 |
|
Бактериальные удобрения на основе клубеньковых бактерий, нитрагин и ризоторфин
ЛЕКЦИЯ №6
ТЕМА: «Получение азотфиксирующих препаратов»
План:
Свойства клубеньковых бактерий.
Препараты клубеньковых бактерий.
Выращивание и хранение клубеньковых бактерий.
Свойства клубеньковых бактерий.
Клубеньковые бактерии (лат. Rhizobium) —бактерии, которые способны связывать неорганический, атмосферный азот продуцируя органические азотсодержащие вещества. Клубеньковые бактерии, обитающие в корнях бобовых растений, являются симбионтами.
Клубеньковые бактерии относятся к роду Rhizobium. Они обладают свойством фиксировать азот из атмосферного воздуха и синтезировать органические азотсодержащие соединения. Эти микроорганизмы образуют на корнях некоторых бобовых растений клубеньки, вступая в симбиоз. Данные бактерии переводят азот в соединения, легко доступные для усвоения растениями, а цветковые растения, в свою очередь, являются источниками питательных веществ для клубеньковых бактерий. Также данный вид бактерий является важным звеном в процессе обогащения почвы азотом.
После проникновения в корневой волосок бактерии вызывают интенсивное деление клеток корня, в результате чего появляется клубенек. Сами бактерии развиваются в этих клубеньках на корнях, участвуя в ассимиляции азота. Там они трансформируются в разветвленные формы – бактероиды, поглощающие молекулярный азот, аммонийные соли, аминокислоты, нитраты. В качестве источника углерода клубеньковые бактерии используют моносахариды, дисахариды, спирты, органические кислоты.
Клубеньковые бактерии имеют размеры от 0,5 до 3 мкм. Они не образуют спор, подвижны, грамотрицательны. Нуждаются в доступе кислорода для нормального протекания обменных процессов. В лабораторных условиях колонии клубеньковых бактерий хорошо растут при температуре 25 градусов на плотных средах. Они имеют характерную округлую форму, слизистой консистенции, прозрачные.
Клубеньковые бактерии обитают на корнях у 10% растений из семейства бобовых. Причем разные виды бактерий развиваются на корневой системе определенных высших растений. У вики, кормовых бобов, гороха - Rh. Leguminosarum, у донника, люцерны - Rhizobium meliloti, у сои - Rh. Japonicum, у клевера - Rh. Trifolii. Если корни бобовых отмирают, а клубеньки разрушаются, клубеньковые бактерии не погибают, а ведут образ жизни сапрофитов.
Эти бактерии поглощают из атмосферного воздуха до 300 кг азота на 1 га, при этом в ходе их жизнедеятельности в почве остается более 50 кг азотсодержащих соединений. Чтобы повысить количество клубеньковых бактерий в почве и, соответственно, урожайность культурных бобовых растений, при посадке семян добавляют бактериальное средство – нитрагин, то есть искусственно заражают семена бобовых клубеньковыми бактериями.
Препараты клубеньковых бактерий
Бактериальные удобрения на основе клубеньковых бактерий, нитрагин и ризоторфин
Микрофлора почвы оказывает непосредственное влияние на её плодородие и, как следствие, на урожайность растений. Почвенные микроорганизмы в процессе роста и развития улучшают структуру почвы, накапливают в ней питательные вещества, минерализуют различные органические соединения, превращая их в легко усвояемые растением компоненты питания. Для стимуляции этих процессов применяют различные бактериальные удобрения, обогащающие ризосферу растений полезными микроорганизмами. Микроорганизмы, используемые для производства бактериальных препаратов, способствуют снабжению растений не только элементами минерального питания, но и физиологически активными веществами (фитогормонами, витаминами и др.).
В настоящее время выпускают такие бактериальные удобрения, как нитрагин, ризоторфин, азотобактерин, фосфобактерин, экстрасол.
Технология получения препаратов клубеньковых бактерий
Отечественная промышленность выпускает два вида препаратов клубеньковых бактерий: нитрагин и ризоторфин. Оба препарата производятся на основе активных жизнеспособных клубеньковых бактерий из рода Rhizobium. Эти бактерии в симбиозе с бобовыми культурами способны фиксировать свободный азот атмосферы, превращая его в соединения, легкоусвояемые растением.
Бактерии рода Rhizobium - строгие аэробы. Среди них различают активные, малоактивные и неактивные культуры. Критерием активности клубеньковых бактерий служит их способность в симбиозе с бобовым растением фиксировать атмосферный азот и использовать его в виде соединений для корневого питания растений.
Фиксация атмосферного азота возможна только в клубеньках, образующихся на корнях растений. Возникают они при инфицировании корневой системы бактериями из рода Rhizobium. Заражение корневой системы происходит через молодые корневые волоски. После внедрения бактерии прорастают внутри них до самого основания в виде инфекционной нити. Выросшие нити проникают сквозь стенки эпидермиса в кору корня, разветвляются и распределяются по клетками коры. При этом индуцируется деление клеток хозяина и разрастание тканей. В месте локализации бактерий на корне растения-хозяина образуются клубеньки, в которых бактерии быстро размножаются и располагаются по отдельности или группами в цитоплазме растительных клеток. Сами бактериальные клетки увеличиваются в несколько раз и меняют окраску. Если клубеньки имеют красноватую или розовую окраску, обусловленную наличием пигмента легоглобина (леггемоглобина) - аналог гемоглобина крови животных, то они способны фиксировать молекулярный азот. Неокрашенные ("пустые") или имеющие зеленоватую окраску клубеньки не фиксируют азот.
Бактерии, находящиеся в клубеньках, синтезируют ферментную систему с нитрогеназной активностью, восстанавливающую молекулярный азот до аммиака. Ассимиляция аммиака происходит, в основном, путем вовлечения его в ряд ферментативных превращений, приводящих к образованию глутамина и глутаминовой кислоты, идущих в дальнейшем на биосинтез белка.
Помимо критерия активности в характеристике клубеньковых бактерий используют критерий вирулентности. Он характеризует способность микроорганизма вступать в симбиоз с бобовым растением, то есть проникать через корневые волоски внутрь корня и вызывать образование клубеньков. Большое значение имеет скорость такого проникновения. В симбиотическом комплексе растение - Rhizobium бактерии обеспечиваются питательными веществами, а сами снабжают растение азотистым питанием. С вирулентностью связана и видовая избирательность, которая характеризует способность данного вида бактерий к симбиозу с определенным видом бобового растения. Классификация различных видов Rhizobium учитывает растение-хозяина, например: Rhizobium phaseoli - для фасоли, Rhizobium lupini - для люпина, сараделлы и т.д. Вирулентность и видоспецифичность взаимосвязаны и не являются постоянными свойствами штамма.
Задачей производства бактериальных удобрения является максимальное накопление жизнеспособных клеток, сохранение их жизнеспособности на всех стадиях технологического процесса, приготовление на их основе готовых форм препарата с сохранением активности в течение гарантийного срока хранения.
Отечественная промышленность выпускает два вида нитрагина: почвенный и сухой. Впервые культура клубеньковых бактерий на почвенном субстрате была приготовлена в 1911 году на бактериально-агрономической станции в Москве. В настоящее время его производство имеет ограниченное значение, так как технология довольно сложна и трудоёмка при выполнении отдельных операций. Более перспективна технология производства сухого нитрагина.
Сухой нитрагин - порошок светло-серого цвета, содержащий в 1 г не менее 9 млрд. жизнеспособных бактерий в смеси с наполнителем. Влажность не превышает 5-7%. Промышленное производство имеет типичную схему. Необходимо отметить, что важно подбирать штаммы, устойчивые к высушиванию. Для производства посевного материала исходную культуру клубеньковых бактерий выращивают на агаризованной среде, содержащей отвар бобовых семян, 2% агара и 1% сахарозы, затем культуру размножают в колбах на жидкой питательной среде в течение 1-2 суток при 28-30оС и рН 6.5-7.5. На всех этапах промышленного культивирования применяют питательную среду, включающую такие компоненты, как меласса, кукурузный экстракт, минеральные соли в виде сульфатов аммония и магния, мел, хлорид натрия и двузамещенный фосфат калия. Основная ферментация идет при тех же условиях в течение 2-3 суток. Готовую культуральную жидкость сепарируют, получается биомасса в виде пасты с влажностью 70-80%. Пасту смешивают с защитной средой, содержащей тиомочевину и мелассу (1:20) и направляют на высушивание. Сушат путем сублимации ( в вакуум-сушильных шкафах). Высушенную биомассу размалывают. Производительнее высушивание в распылительных сушках, но при этом 75% клеток теряют жизнеспособность. Препараты сухого нитрагина фасуют и герметизируют в полиэтиленовые пакеты по 0.2 - 1 кг, хранят при температуре 15оС не более 6 месяцев. Семена опудривают перед посевом. Внесение нитрагина повышает урожайность в среднем на 15-25%.
Препарат клубеньковых бактерий может выпускаться и в виде ризоторфина. Впервые торфяной препарат клубеньковых бактерий был приготовлен в 30-х годах, но технология была создана в 1973-77 гг. Для приготовления ризоторфина торф сушат при температуре не выше 100оС и размалывают в порошок. Наиболее эффективным способом стерилизации является облучение его гамма-лучами. Перед стерилизацией размолотый, нейтрализованный мелом и увлажненный до 30-40% торф расфасовывают в полиэтиленовые пакеты. Затем его облучают и заражают клубеньковыми бактериями, используя шприц, с помощью которого впрыскивается питательная среда, содержащая клубеньковые бактерии. Прокол после внесения бактерий заклеивается липкой лентой. Каждый грамм ризоторфина должен содержать не менее 2.5 млрд. жизнеспособных клеток с высокой конкурентоспособностью и интенсивной азотфиксацией. Препарат хранят при температуре 5-6оС и влажности воздуха 40-55%. Пакеты могут быть весом от 0.2 до 1.0 кг. Доза препарата составляет 200 г на га. Заражение семян производят следующем образом: ризоторфин разбавляют водой и процеживают через двойной слой марли. Полученной суспензией обрабатывают семена. Семена высевают в день обработки или на следующий.
Обработка семян бобовых культур прочно вошла в мировую сельскохозяйственную практику. Крупнейшими производителями таких препаратов являются США и Австралия.