 |
|
Історія розвитку клінічної біохімії
Біохімія як наука сформувалась на зламі ХІХ і ХХ ст. Одним із відомих осередків біохімічних досліджень у цей час була Прага. Його створив видатний український біохімік, згодом академік, Іван Горбачевський, який здобув славу першим синтезом сечової кислоти у 1882 р., а потім з’ясував, що джерелом її утворення в організмі тварин є нуклеїнові кислоти. Професор І. Горбачевський ще в 1883 р. грунтовно розглянув суть захворювання на уремію, а в 1909–1912 рр. провів дослідження причин виникнення пелагри, що стало суттєвим кроком у започаткуванні клінічної біохімії як науки. У 20-х роках ХХ ст. ці дослідження одержали повне підтвердження.
Роботи професора І.Горбачевського були близькими з напрямком досліджень іншого видатного вченого – доктора медицини і філософії, доктора біологічних наук, професора Вацлава Морачевського, одного з тих, хто спричинився до наукової слави Львівської академії ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького. Науково-педагогічна діяль-ність професора В. Морачевського була різноплановою. Перші наукові дослідження, проведені ним у хімічній лабораторії Цюріхського університету, присвячені характеристиці мінерального обміну при інфекційних хворобах, лейкемії, анемії, раку. Ряд робіт стосувалися методів дослідження обміну речовин при діабеті. Цими працями В.Морачевський започаткував новий напрямок у науці – клінічну біохімію і видрукував їх у 1904 р. як посібник з клініко-хімічних досліджень.
Професор В.І.Морачевський був ученим з великим діапазоном наукових зацікавлень. Окрім енциклопедичних знань у галузі гуманітарної і ветеринарної медицини, біології та філософії, він вважався одним із відомих знавців літератури, музики і мистецтва, відіграв провідну роль у творчому зростанні таланту В.Стефаника. Протягом 1925–1927 рр. він був ректором Львівської академії ветеринарної медицини. В.Морачевський виділявся серед поль-ської професури академії своєю прихильністю до українських студентів, був єдиним професором академії, який уможливив наукову кар’єру українця С.Гжицького.
С.З.Гжицький у 1929 р. закінчив академію, а в 1931 р. захистив дисертацію й отримав науковий ступінь доктора ветеринарної медицини. Він започаткував на кафедрі біохімії академії вивчення біохімічних процесів, що відбуваються у м’язах. Ці дослідження стали початком розвитку нового напрямку в біохімії, який дещо пізніше був названий клінічною біохімією. С.З.Гжицький вивчав біохімічні процеси при паралітичній міоглобінурії коней, що дозволило узагальнити патогенез цієї хвороби, обмін речовин у коней, хворих на правець та енцефаломієліт, у собак, хворих на лептоспіроз. У післявоєнний період С.З.Гжицьким та його учнями були продовжені дослідження з клінічної біохімії, зокрема, досліджувалися біохімічні процеси при коліках у коней (Германюк Я.Л.), хронічній гематурії великої рогатої худоби (Головач В.М., Палфій Ф.Ю., Кусень С.Й.), атонії передшлунків у корів (Вовк І.Н., Германюк Я.Л., Братківський Є.І., Головацький І.Д. та ін.).
С.З.Гжицький своєю феноменальною працездатністю, добротою, чуйністю і громадянською позицією в житті вписав золоту сторінку в історію клінічної біохімії. Науковий "почерк" його біохімічної школи відомий у всьому світі. С.З.Гжицьким було підготовлено 16 докторів і 52 кандидати наук. Його учнями у свій час були академіки П.З.Лагодюк, Ф.Ю.Палфій, І.А.Макар, професори І.Д.Головацький, Я.Л.Германюк, С.Й.Кусень, В.М.Головач, В.Й.Скорохід, І.І.Розгоні, О.Ф.Явоненко, О.М.Лемішко, І.Г.Пупін.
Світове визнання українській біохімії принесли дослідження львівського вченого Я.О.Парнаса (1889–1949) – співавтора схеми анаеробного розщеплення вуглеводів Ембдена–Мейєргофа–Парнаса.
Окрім львівської школи, в Україні працюють всесвітньо відомі київський і харківський центри біохімічних досліджень. О.Я.Дани-левський (1838–1923) глибоко й грунтовно вивчив білки органів і тканин, розробив поліпептидну теорію будови білкової молекули, вперше у чистому вигляді виділив трипсин та амілазу, припустив існування антиферментів. Академік О.В.Палладін (1885–1972) та його учні виконали ряд фундаментальних досліджень з усіх розділів біохімії, насамперед з нейрохімії, біохімії м’язової тканини, білків, вітамінів (Курський М.Д., Вендт В.П., Бєлік Я.В., Чаговець Р.В., Гулий М.Ф., Мельничук Д.О., Комісаренко В.П., Мацука Г.Х. та ін.).
Теоретичні основи вивчення мікроелементозів започаткував академік В.І.Вернадський (1863–1945), який висловив гіпотезу про нерозривний зв’язок елементарного складу організму і складу земної кори. Один із найближчих учнів В.І.Вернадського академік О.П.Виноградов розробив учення про біогеохімічні провінції та біогеохімічні ендемії.
У науково-дослідних інститутах та кафедрах біохімії вузів України проводяться дослідження з різних розділів клінічної біохімії. Ряд фундаментальних досліджень з вивчення механізмів регуляції біосин-тезу білка і підвищення рівня продуктивності сільськогосподарсь-
ких тварин проводять науковці київської біохімічної школи під керів-ництвом академіків М.Ф.Гулого і Д.О.Мельничука. Значних успіхів у вивченні особливостей обміну речовин у домашніх тварин досягнуто харківською біохімічною школою (Савронь О.С., Чечоткін О.В., Воронянський В.І.), біохімії та обміну макро- і мікроелементів, біохімічної екології та хімічної архітектоніки нервової системи – білоцерківськими біохіміками (Кононський О.І., Герасименко В.Г.).
Великий внесок у розвиток клінічної біохімії зробили вчені-клініцисти, насамперед інтерністи, при вивченні патогенезу і методів діагностики внутрішніх неінфекційних хвороб тварин.
Видано кілька класичних книг із клінічної біохімії, зокрема “Основы клинической биохимии в клинике внутренних болезней” за редакцією Ярослава Горжейші (1967); “Клиническая биохимия” – автор В.Маршал (2000); “Основы биохимических процессов” – Я.Мусил (1985); “Клиническая биохимия” – автори Є.Ф.Шамрай і О.Ю.Па- щенко (1970) та “Клиническая биохимия сельскохозяйственных животных” Є.О.Васильєвої (1982). Важливим внеском у розвиток клінічної біохімії стало видання у 1976 році книги професора О.І.Ко-нонського “Гістохімія”.
Нині предмет “Клінічна біохімія” є обов’язковим при підготовці лікаря ветеринарної медицини. Він викладається фахівцями-біохі-міками або клініцистами. Поєднання цих напрямів взаємозбагачує науку, яка є і фундаментальною, і прикладною.
Об’єкт дослідження
клінічної біохімії
Об’єктом дослідження клінічної біохімії є кров, сеча, молоко, органи і тканини, уміст рубця, шлунковий сік, слина, ліквор та інші біологічні субстрати організму тварин.
Кров є основним об’єктом досліджень. Для біохімічного дослід-ження у великої рогатої худоби, коней, овець, кіз і верблюдів кров беруть із яремної вени; у свиней – із судин хвоста, краніальної порожнистої вени, орбітального венозного синуса; у м’ясоїдних (собак, котів) – із поверхневих вен кінцівок (підшкірної вени передпліччя, латеральної підшкірної вени гомілки – вени сафена); у хутрових звірів – із м’якушів пальців; у птахів – з підкрильцевої вени; у кролів – з яремної вени, судин хвоста, вуха, серця; у риб – із серця, з підшкірної чи хвостової артерії. У птахів кров швидко згортається, тому її набирають у маленькі пробірки через розріз підкрильцевої вени без голки.
У моногастричних тварин кров відбирають уранці натще, у жуйних – зранку через 4 години після годівлі. Час годівлі суттєво впливає на вміст у крові ліпідів, глюкози, холестеролу та деяких інших показників. Надмірне збудження тварини під час відбору крові зумовлює зміни рів-ня глюкози, кислотно-лужної рівноваги, гормонів, тому слід уникати зайвого насилля над пацієнтом, а інколи слід застосовувати транквілізатори. Визначаючи стан обміну речовин, кров чи інші біологічні субстрати відбирають у тварин без ознак запального характеру (хірургічна інфекція, ендометрит, ретикулоперитоніт та ін.), тому що за таких умов змінюються біохімічні показники досліджуваного субстрату.
При клінічному лабораторному аналізі частіше досліджують сироватку і плазму крові. У крові визначають морфологічні показники, гематокритну величину, уміст гемоглобіну, глюкози, кетонових тіл, міді, цинку, кобальту, марганцю, селену та ін.; у плазмі крові – резервну лужність, уміст натрію, калію, можливо, неорганічного фосфору, у сироватці крові – загального білка та його фракцій, залишкового азоту, сечовини, ліпідів, білірубіну, кальцію, фосфору, магнію, загаль-ного і зв’язаного з білками йоду, заліза, міді, цинку, кобальту, селену, марганцю, каротину, вітамінів, ферментів, виконують білково-осадові проби. У дрібних тварин і птиці замість сироватки можна використовувати плазму крові, враховуючи підбір антикоагулянта. Зважаючи на характер дослідження, готують одну або дві пробірки. Для стабілізації крові чи одержання плазми у пробірки вносять один із антикоагулянтів із розрахунку на 10 мл крові: 3 краплі 1 %-ного розчину гепарину, 2–3 краплі гепарину, що містить 500 ОД в 1 мл; 0,3–0,5 мл 10 %-ного розчину натрію лимоннокислого (цитрату); 0,3–0,5 мл 20 %-ного розчину натрію чи калію щевлевокислого (оксалату); 3–4 краплі трилону Б (ЕДТА-натрію); 5–10 крапель 10 %-ного розчину натрію фториду. Основні вимоги до підбору матеріалу, вибору антикоагулянту, умов зберігання зразка крові та строків виконання аналізів викладені в таблиці 1.
Таблиця 1 – Матеріал для дослідження, антикоагулянт, умови зберігання зразка, строки проведення аналізу
| Показник | Матеріал для дослід-ження, антикоагулянт | Умови зберігання, строки дослідження | ||||
| Гематокрит | К, ЕДТА-натрію | Величина стабільна 48 год за зберігання при 4°С або 6 год за температури 23°С | ||||
| Гемоглобін | К, ЕДТА-натрію, можливі гепарин, цитрат, оксалат | Стабільний протягом 48 год за температури 4°С, 24 год – за температури 23°С | ||||
| Глюкоза | К, ПК, натрію фторид. Осаджування білків відразу після взяття крові | Зберігання крові не більше 2 год. Для одержання плазми кров негайно центрифугують, білок осаджують, підготовлений матеріал зберігають при 4°С не більше 24 год | ||||
| Кетонові тіла | К, гепарин. Приготування безбілкового фільтрату в день відбору крові | Зберігання безбілкового фільтрату в холодильнику до 3 діб | ||||
| Резервна лужність | ПК, СК, гепарин, ЕДТА-натрію та ін. | Зберігання в холодильнику до 3 діб | ||||
| Фосфор неорганічний | ПК, СК, гепарин та ін. Швидко відділити сироватку чи плазму, не допускати гемолізу еритроцитів | Зберігати в холодильнику до двох діб. При тривалому зберіганні вміст фосфору зростає | ||||
| Калій | ПК, гепарин та ін. СК без слідів гемолізу | Зберігання в холодильнику до 5-ти діб | ||||
| Кальцій | СК без слідів гемолізу | Зберігання в холодильнику до трьох діб | ||||
| Залізо | СК без слідів гемолізу | Зберігання в холодильнику 3 доби | ||||
| Загальний білок | СК без слідів гемолізу. ПК, гепарин та ін. | Зберігання в холодильнику до трьох діб | ||||
| Білкові фракції | СК без слідів гемолізу | Зберігання в холодильнику до трьох діб | ||||
| Білірубін | СК без слідів гемолізу | Зберігання в холодильнику до 3-х діб. Захищати від сонячного проміння | ||||
| Холестерол (холестерин) | ПК, ЕДТА-натрію, гепарин, але не оксалат, цитрат. СК або ПК без слідів гемолізу | Проба стабільна за кімнатної температури до 5-ти діб | ||||
| Ретинол, каротин | СК без слідів гемолізу | Захищати від сонячного світла. Заморожена проба стабільна упродовж двох тижнів | ||||
| Вітамін С | ПК. Гепарин та ін. СК без слідів гемолізу | Проба стабільна протягом 3-х год при її охолодженні | ||||
| Вітамін Е | СК без слідів гемолізу | Плазму та сироватку крові стабілізують метафосфорною кислотою: 5 г/100 мл або ТХО: 10 г/100 мл. Зберігають при 20°С протягом одної доби. Захищають від сонячного світла. Зберігають у холодильнику кілька днів при 4°С | ||||
| Лактатдегідрогеназа | СК або ПК без слідів гемолізу. Гепарин | Не охолоджують, досліджують у день відбору крові | ||||
| Аспартатаміно-трансфераза | СК або ПК без слідів гемолізу. Гепарин | Досліджують протягом 24 год після відбору крові. Можна зберігати 4–7 днів при 2–4°С | ||||
| Аланінаміно- трансфераза | СК без слідів гемолізу. Гепарин | Досліджують протягом 24 год після взяття крові. Можна зберігати протягом 4-х днів при 4°С | ||||
| Холінестераза | СК без слідів гемолізу. Гепарин, ЕДТА-натрію, цитрату чи оксалату. Плазму крові досліджувати не можна | Стабільна за кімнатної температури 6 год, при 4°С – один тиждень | ||||
Примітки:К – кров, ПК – плазма крові, СК – сироватка крові
Сеча. Проби сечі беруть від тварин у ранкові години при природному сечовипусканні або при спонуканні їх до цього масажем шкіри біля соромітних губ у самок або спеціальними методами (катетеризація, цистоскопія). У собак та кішок можливий цистоцентез. Аналіз сечі проводять безпосередньо на фермі або в лабораторії в день її взяття. Сечу збирають у чистий сухий посуд. Зберігають до тестування не більше 11–12 год у холодильнику. Як виняток, допускають застосування консервантів (кристалик тимолу на 100–150 мл сечі). При дослідженні уробіліногену сечу захищають від сонячного світла, аналіз доцільно виконувати протягом 30 хв після відбору зразка сечі.
Молоко. З діагностичною метою молоко досліджують рідко. Як правило, його досліджують для діагностики кетозу у корів та вівцематок. Зразки молока саме для цієї мети беруть із здорових чвертей вимені. Зазвичай проводять якісні реакції безпосередньо на фермі. У молоці можна визначити вміст загального білка, кальцію, фосфору, магнію, мікроелементів, вітамінів А, Е та ін. Досліджують молоко ранкового надою. Велике значення має біологічна оцінка якості молозива, особливо визначення в ньому вмісту імунних глобулінів (Ig G, Ig M, Ig E, Ig A), від чого залежить стан здоров’я новонароджених тварин. Зразки молозива відбирають із здорових чвертей вимені з обов’яз-ковим зазначенням порядкового номера надою, оскільки склад молозива дуже швидко змінюється: молозиво першого надою за своїм складом відрізняється від молозива другого та наступних надоїв. Підготовка зразків молока і молозива залежить від характеру дослідження.
Вміст рубця. Вміст рубця беруть через 3–4 год після годівлі за допомогою стравохідного зонда, не допускаючи попадання в нього слини, і відразу фільтрують через 4 шари марлі. Склянку із вмістом закривають, ставлять у холодильник і відразу ж досліджують. Якщо проби відбирають у господарстві, то їх консервують хлороформом або толуолом з розрахунку 6–8 крапель на 20 мл вмісту. Транспортують проби у термосі з льодом. Якщо у пробах планується підрахунок кількості найпростіших, то як консервант використовують 10 %-ний розчин формаліну з розрахунку 5–6 крапель на 20 мл вмісту. Від формаліну найпростіші втрачають рухомість, припиняється їх розвиток та розмноження і настає лізис.
Шлунковий вміст і сік. Проби шлункового вмісту та шлункового соку беруть за допомогою спеціальних шлункових зондів після попередньої підготовки тварини в режимі голодної дієти.
Методика підготовки тварин, взяття шлункового вмісту та шлункового соку викладені у підручнику “Клінічна діагностика хвороб тварин”.
Найбільше діагностичне значення має дослідження шлункового соку, оскільки в ньому немає залишків кормових мас. Інформативними є такі показники: рН, загальна кислотність, вільна та зв’язана соляна кислота, пептидна активність соку та ін.
Ліквор (спинномозкова рідина) секретується судинними сплетіннями центральної нервової системи і циркулює у спеціальних резервуарах чи цистернах у ділянці основи мозку, омиваючи звивини головного мозку, випуклу поверхню мозку, центральний канал і підпавутинний простір спинного мозку. Утворюється ліквор у бокових шлуночках мозку та субарахноїдальних проміжках. Вода і електроліти швидко проникають у церебральну рідину і так само швидко виходять з неї.
Ліквор виконує функцію "подушки" для мозку, запобігаючи його зміщенню. Метаболічна роль ліквору досі не вивчена. Тому дослідження його виконують здебільшого з метою діагностики запальних процесів у центральній нервовій системі.
Одержують ліквор шляхом люмбальної субокципітальної і пост-окципітальної пункції, яку виконують спеціальними голками з мандреном: у великих тварин – довжиною 80–150 мм і діаметром 1,2–1,8 мм. Для лабораторних досліджень ліквор беруть фракціями у 3–4 пробірки загальною кількістю 5–15 мл. Для підрахунку клітин достатньо 0,5 мл. До ліквору, який містить фібриноген, що буває при менінгітах, додають антикоагулянт.
Відносна щільність ліквору здорових тварин – 1,004–1,008 кг/л, уміст глюкози – 2,2–3,5 ммоль/л, загального білка – 0,15–0,30 г/л, лейкоцитів – від 0 до 8×106/л (0–8 в 1 мкл). Лейкограма ліквору в основному представлена лімфоцитами (60–80 %) і моноцитами (20–40 %).
Спинномозкова рідина за кольором світла і прозора. Її помутніння вказує на наявність гнійного менінгіту. Виявлення в 1 мкл більше ніж 500 еритроцитів свідчить про наявність крові в лікворі. Зниження вмісту глюкози в лікворі спостерігають при менінгоенцефаліті, пухлинах, післяпологовій гіпокальціємії. Підвищення концентрації глюкози в лікворі виявляють при стресі, цукровому діабеті, лістеріозі, травмах. Дослідження кількості білка у лікворі має важливе діагностичне значення при патології мозку. Підвищення його вмісту (гіперпротеїнрахія), в основному за рахунок високодисперсних фракцій, буває при пухлинах, лістеріозі, менінгіті, менінгоенцефаліті.
Підвищення кількості лейкоцитів (плеоцитоз) вказує на ураження патологічним процесом мозкових оболонок чи розвиток у них запаль-них явищ. Особливо різкий плеоцитоз виявляють при менінгітах. При серозному менінгіті в 1 мкл ліквору міститься від декількох десятків до сотень клітин (при нормі 3–8 клітин), в основному лімфоцитів. При гнійному менінгіті в гострій стадії захворювання кількість клітин досягає кількох тисяч, і навіть десятків тисяч у 1 мкл ліквору. Причому, серед клітин переважають нейтрофіли.
Кістково-мозковий пунктат. Одержують із 2–3 сегментів грудної кістки за допомогою спеціальних голок (ГС–2 та ін.) з мандреном. Дослід-ження виконують для діагностики гемобластозів. У пунктаті визначають кількість еритроцитів, оксифільних нормоцитів, поліморфноядерних нормоцитів (ядерновмісних клітин). У фарбованих мазках підраховують мієлограму. Аналізуючи мієлограму, визначають кількісне співвідношення між клітинами різного ступеня зрілості еритро- та лейкопоезу.
Біопсійний пунктат печінки. Біопсію печінки виконують для гістологічних, гістохімічних та ультрамікроскопічних досліджень. Біоптат отримують за допомогою спеціальних голок з мандренами або троакаром конструкції С.Нікова, В.Уша та інших дослідників. Біоптат фіксують і обробляють різними методами, залежно від мети досліджень. Гістологічні дослідження проводять для диференційної діагностики хвороб печінки, в основному – характеру дистрофії, гістохімічні та електронномікроскопічні – для функціональної та структур-ної оцінки гепатоцитів та їх органел.
Досліджуючи зразки біологічних субстратів (крові, сечі та ін.), враховують вік, породу, фізіологічний стан тварини. Наприклад, уміст імунних глобулінів сироватки крові телят проводять через 24–48 год після народження, тобто, коли в їх організм надходять колостральні імунні білки з молозива. Потім дослідження цих показників (за необхідності) виконують у віці трьох тижнів та трьох місяців.
Вік тварин враховують при дослідженні в крові загального білка та його фракцій, глюкози, фосфору, холестеролу, класів ліпідів та деяких інших показників, що мають суттєві відмінності в молодих і дорослих особин.