Versuch 9.1: Induktion und Katabolitrepression am Beispiel des lac-Operons

Studiengang Medizin

Protokoll

Thema: Proteinbiosynthese und Genregulation

Block: 9 Gruppe: F Platz: 8

Mit unserer Unterschrift bestätigen wir, das folgende Protokoll eigenständig und unter Berücksichtigung der Verpflichtung zur guten wissenschaftlichen Praxis angefertigt zu haben (http://www.uni-luebeck.de/forschung/gute-wissenschaftliche-praxis.html).

Namen:

Krystsina Miadzvedzeva Oleksandra Gerasymenko

............................... ............................... ...............................

Unterschrift 1 Unterschrift 2 Eingangsstempel

Beurteilung des Protokolls

Gesamtnote: ____________ ____________________________

Betreuende/er Assistent/in

Verbesserungswürdig:		Bemerkungen
Umfang
Ergebnisse
Klinischer Bezug
Rechenwege
Graphiken
Diskussion
MC-Fragen

Korrektur: Nein Ja, bis: ___________

Versuch 9.1: Induktion und Katabolitrepression am Beispiel des lac-Operons

Durchführung:

Siehe Praktikumsskript Ss.63-66

Ergebnisse:

Die gemessenen Extinktionen und die daraus berechneten Volumenaktivitäten der ß-Galactosidase sehen Sie im Datenblatt.

Berechnungen:

Aus den Extinktionen werden nach dem Lambert Beerschen Gesetz die Volumenaktivitäten in mU/ml Zelllysat der ß-Galactosidase in den einzelnen Ansätzen berechnet.

Der Rechenweg wird am Beispiel des Ansatzes A3 dargestellt.

bekannt: ε _{(0-Nitrophenolat) 405nm} = 20000 M^-1 cm^-1 = 20000 l / mol x cm = 0,02 ml / nmol x cm

d= 1cm

∆t = 4.5 min

Extinktion: 0,018

Berechnung der Verdünnung:

V_gesamt= V_Enzympuffer+ V_ONPG+ V_{Zelllysat/ Wasser}+ V_{Natriumcarbonat}

V_gesamt= 2 ml + 0,5 ml + 0,5 ml + 1 ml

V_gesamt= 4 ml

x = V_Zelllysat/ V_gesamt

x = 0,5 ml/ 4 ml

x = 0,125

Berechnung der Volumenaktivität:

Lambert-Beer‘sches-Gesetz:

E = c x d x ε

c = E / (d x ε)

Uv = Dc / Dt = DE / (Dt ´ d ´ e ´ x)

Uv = DE / (Dt ´ d ´ e ´ x)

U = μmol/ min , infolgedessen Uv = mU / ml = nmol / min ´ ml

Uv = 0,018 / (4,5min ´ 1cm ´ 0,02ml/ nmol xcm ´ 0,125)=1,6 mU / ml

Die Volumenaktivitäten in den Versuchen 9.2 und 9.3 werden in die gleiche Weise berechnet.

Diskussion:

Im Versuch 9.1 haben wir Induktion und Katabolitrepression am Beispiel des lac-Operons von lebenden E.coli Zellen untersucht. Das lac-Operon ist aus dem Promotor, dem Operator, woran der Repressor binden kann, und den Genen, die nacheinander liegen und Enzyme kodieren, zusammengesetzt. Ein von diesen Enzymen ist beta-Galactosidase, deren Volumenaktivität wir mithilfe des optischen Tests und Lambert-Berr’sches Gesetzes bestimmt haben und das dafür sorgt, dass Lactose gespalten wird und von E.coli verstoffwechselt werden kann. Wenn um E.coli Zellen herum keine Lactose vorhanden ist, ist es sinnlos, das Enzym zu exsprimieren, was Lactose als Substrat hat. Deswegen muss die Exspression des lac- Operons gehemmt werden, was anhand des Repressors unterdrückt wird, was vom lac I Gen, das vor dem lac-Operon liegt, kodieret wird. Im Gegensatz zu dieser Situation wird die beta-Galactosidasegenexspression enthemmt, wenn ein Induktor den Repressor bindet und dessen Konformationsänderung veranlasst. Der Repressor ist nicht mehr in der Lage, an den lac-Operator zu binden, und RNA-Polymerase kann an Promotor binden, Gene des lac-Operons ablesen und die Enzyme werden synthetisiert. In dem Fall kann Allolactose (was aus der Lactose durch Isomerisation gebildet wird)als Induktor dienen oder IPTG, was wir im Versuch auch als Induktor benutzen.

Ein Prozess, der bei der Regulation der Genexspression eine wichtige Rolle spielt, wird als Katabolitrepression bezeichnet. Damit wird sichergestellt, dass die Glucose , wenn sie im Medium vorhanden ist, als erste metabolisiert wird. Geregelt wird es mithilfe von CAP-Protein(„catabolite gen activator protein”), das die Exspression von lac-Operon begünstigt, wenn es mit cAMP gebunden vorliegt. Die cAMP Konzentration in der Zelle wird stark von dem Vorhandensein der Glucose als Substrat intrazellulär beeinflusst. Das Fehlen von Glucose verursacht den Anstieg der cAMP Konzentration, was in Wechselwirkung mit dem CAP-Protein tritt und dadurch die beta-Galactosdasesynthese fördert. Die Lactose kann dementsprechend verstoffwechselt werden. In dem Versuch haben wir betrachtet, wie effektiv die Exspression des beta-Galactosidasegens abläuft in der Abhängigkeit davon, was für Substrate zu den Zellen zugesetzt wurden und wann(nach 6 oder 10 Minuten) die Reaktion gestoppt wurde. Ansatz A: Es wurde nur Lactose als Substrat zugegeben. Es ist zu sehen, dass die Volumenaktivität der beta-Galactosidase und dementsprechend die Exspression im Ansatz A3 im Vergleich zum Ansatz D3(die Probe, die kein Substrat enthält) höher ist und mit der Zeit steigt noch auf ca.10 mU/ml Zelllysat. Das bedeutet einfach, dass die Lactose die Exspression von beta-Galactosidase induziert, damit sie als „Nahrungsmittel” für die Zellen dienen kann. Ansatz B:enthält zwei Substrate, sowohl Lactose als auch Galactose. Obwohl man aufgrund der Katabolitrepression keine Galactosidaseaktivität erwarten könnte, sieht man, dass die trotzdem vorhanden ist. Es kann daran liegen, dass durch das Vorhandensein des Induktors in Form von Galactose der Repressor gebunden wird, die Promotorregion freigelegt wird und die RNA-Polymerase die Gene ablesen kann. Es erfolgt die Enthemmung der Exspression des beta-Galactosidasegens. Im Ansatz liegt aber auch Glucose vor, was den niedrigen cAMP Spiegel bewirkt. Das CAP-Protein, was in diesem Fall die Genexspression beschleunigt und im Prinzip für die effektive Exspression unerlässlich ist, liegt in der nicht cAMP gebundenen Form vor und kann seine Wirkung nicht entfalten, deshalb ist die beta-Galactosidase vorhanden aber nur in geringen Konzentrationen. Nach 10 Minuten nimmt die Enzymaktivität ein wenig zu, aber im Vergleich zum Ansatz A10 ist der Anstieg in Wirklichkeit gering. Ansatz C:enthält IMPG als Induktor. IMPG kann aber von den Zellen nicht verstoffwechselt werden und ist infolgedessen ein potenterer Induktor als Lactose(in Form von Allolactose). Es lässt sich mithilfe des Diagramms deutlich sehen.

Die Enzymaktivität im Ansatz C nach drei Minuten ist mehr als doppel so hoch wie im Ansatz A3, wo Lactose die Induktorfunktion erfüllt. Und nach zehn Minuten steigt Galactosidaseaktivität im Ansatz C drastisch an und ist immer noch höher als im Ansatz A10.