 |
|
Структура эукариотических генов.
Строение и организация эукариотических генов значительно сложнее, чем у прокариот. Отчасти это обусловлено использованием трех разных систем транскрипции.
Гены класса I, кодирующие 5,8S-, 18S- и 28S-рРНК, транскрибируются РНК-полимеразой I. Все мРНК и ряд малых ядерных РНК (мяРНК) образуются при транскрипции генов класса II с участием РНК-полимеразы II. тРНК и некоторые малые цитоплазматические РНК (мцРНК) образуются при транскрипции генов класса III с участием РНК-полимеразы III.
Естественно, для инициации транскрипции с участием трех разных РНК-полимераз используются разные регуляторные последовательности, при этом они располагаются каждая на определенном расстоянии от точки начала транскрипции. Кроме того, для РНК-полимеразы каждого типа требуются свои вспомогательные белки – факторы транскрипции, которые связываются с этими регуляторными последовательностями.
Последовательности, которые определяют 3'-конец соответствующих функциональных РНК-продуктов (терминаторы) тоже уникальны для каждой полимеразной системы. Они зачастую многочисленны.
В отличие от прокариотических генов, почти всегда коллинеарных своим РНК, многие гены эукариот имеют мозаичное строение, т.е. у них чередуются кодирующие (экзоны) и некодирующие (интроны) последовательности в пределах единицы транскрипции. Интроны чаще всего встречаются в генах, кодирующих белки и тРНК, и реже в генах рРНК. За исключением некоторых генов, кодирующих пять гистонов, интерфероны и белки некоторых вирусов млекопитающих, все гены, кодирующие белки позвоночных, содержат интроны. Редко встречаются интроны в генах дрожжей, отсутствуют почти во всех генах Drosophila. Интроны присутствуют также во многих растительных генах.
Размеры, число и местоположение интронов у разных генов различны. Тем не менее, сходные гены у организмов разных видов часто имеют одинаковое число интронов в одних и тех же позициях, хотя длина и нуклеотидная последовательность интронов могут заметно различаться. Обычно число интронов на ген возрастает пропорционально длине последовательности, кодирующей белок, а размеры экзонов в среднем составляют около 300 п.н. В целом общая длина последовательностей интронов превышает суммарную длину экзонов обычно от двух до десяти раз, а иногда и больше.
Таким образом, к сегментам ДНК, составляющим ген, относятся:
1. Единица транскрипции, которая представляет собой протяженный участок ДНК, кодирующий последовательность первичного транскрипта; в нее входят а) последовательность, кодирующая либо зрелую РНК, либо белковый продукт; б) интроны; в) 5'-лидерная и 3'-трейлерная последовательности, которые присутствуют в зрелых мРНК, а также промежуточные последовательности (спейсеры), которые удаляются в ходе процессинга первичных транскриптов генов, кодирующих РНК.
2. Минимальные последовательности, необходимые для начала правильной транскрипции (промоторы) и для образования правильного 3'-конца зрелой РНК.
3. Последовательности, регулирующие частоту инициации транскрипции; к ним относятся последовательности, ответственные за индуцибельность и репрессию транскрипции, а также клеточную, тканевую и временную специфичность транскрипции. Эти области так разнообразны по строению положению и функциям, что для них трудно найти одно простое и емкое название. К их числу относятся энхансеры и сайленсеры – последовательности, которые оказывают дистанционное влияние на инициацию транскрипции независимо от своей ориентации относительно точки начала транскрипции.
3. . Организация генома прокариот.
У E. coli гены, кодирующие белки одного и того же метаболического пути или определяющие близкородственные функции, часто регулируются согласованно. Это значит, что их экспрессия начинается и заканчивается или согласованно продолжается в ответ на один и тот же регуляторный сигнал. Гены, подчиняющиеся согласованной регуляции, в геноме часто бывают сцеплены и транскрибируются с промотора, находящегося на 5'-конце такой группы генов (кластера), в виде единственной молекулы РНК, называемой полицистронным транскриптом. Группа координированно экспрессирующихся генов называется опероном.
Три гена, кодирующие ферменты, ответственные за метаболизм галактозы у E. coli, организованы в оперон с промотором (Р) и примыкающим к нему регуляторным сегментом – оператором (О) на 5'-конце транскрибируемой последовательности.
Как правило, отдельные опероны, кодирующие родственные функции, имеют одинаковые или сходные регуляторные последовательности и поэтому реагируют на определенный регуляторный сигнал сходным образом.
.
4. Регуляция экспрессии прокариотических генов.
Активность многих промоторов регулируется с помощью особых белков-регуляторов, которые присоединяются к определенным участкам ДНК и либо мешают, либо помогают РНК-полимеразе инициировать синтез РНК. В первом случае говорят о негативной, а во втором – о позитивной регуляции активности промотора.
Белки, осуществляющие негативную регуляцию, называются репрессорами. Места их связывания на ДНК называются операторами (рис.5) Способность многих репрессоров связываться со своими операторами зависит от низкомолекулярных лигандов – эффекторов. Эффекторы, снижающие сродство репрессора к оператору, называются индукторами. В отсутствие индуктора репрессор связывается с оператором и мешает РНК-полимеразе начинать синтез РНК с промотора (промотор репрессирован). В комплексе с индуктором репрессор теряет способность связываться с оператором, в результате чего промотор активируется (индуцируется). Другие репрессоры, наоборот, могут связываться с оператором только в комплексе с эффектором (который в этом случае называется корепрессором). В присутствии корепрессора промотор неактивен (репрессирован), в отсутствие корепрессора активируется (дерепрессируется).
Белки, осуществляющие позитивную регуляцию, называются активаторами. Ряд белков-регуляторов могут выступать как в роли репрессора, так и в роли активатора.
Простейший механизм репрессии заключается в стерическом блокировании репрессором присоединения РНК-полимеразы к промотору. Такой механизм имеет место в тех промоторах, в которых участок связывания репрессора перекрывается с участком связывания РНК-полимеразы. Простейший механизм активации заключается в том, что белок-активатор присоединяется к промотору рядом с РНК-полимеразой и за счет непосредственного контакта с ней облегчает образование открытого промоторного комплекса.
5. . Организация генома эукариот.
Точно так же, как различается строение эукариотических генов и генов прокариот, различается и организация геномов этих двух типов организмов. В бактериальном геноме гены почти непрерывно следуют один за другим по всей длине молекулы ДНК, а в некоторых случаях даже перекрываются. Гены, кодирующие ферменты одного метаболического пути, часто образуют одну единицу транскрипции (оперон). Это способствует наиболее эффективному использованию нуклеотидной последовательности ДНК. Но, по-видимому, для эволюции эукариот принцип экономии был не столь важен, как для эволюции прокариот. Не говоря уже о том, что большую часть ДНК занимают интроны, эукариотические гены разделены длинными некодирующими участками. Большое число генов в одной единице транскрипции встречается редко. Эукариотические геномы содержат гораздо больше ДНК, чем это представляется необходимым. В основном геномы млекопитающих и растений содержат в 20 – 50 раз больше ДНК, чем необходимо для кодирования генов. Существование «избыточной» ДНК отчасти можно объяснить тем, что в геноме имеются интроны и протяженные участки ДНК между генами – межгенные спейсеры.
Большой размер генома эукариот может объясняться и тем, что некоторые гены встречаются в геноме много раз. Свой вклад в «избыточную» ДНК вносят также нефункциональные копии генов, называемые псевдогенами.
Большой размер эукариотических геномов обусловлен также наличием в них множества повторяющихся последовательностей ДНК с неизвестными функциями. На их долю приходится обычно 10%, а в некоторых случаях почти 50% генома. При помощи кинетического анализа реассоциации денатурированной эукариотической ДНК было показано, что значительная часть ДНК ренатурирует гораздо быстрее, чем можно было бы ожидать для уникальных последовательностей ДНК. Высокая скорость реассоциации говорит о том, что такие геномы содержат фрагменты, повторяющиеся от сотен тысяч до миллионов раз. В настоящее время с помощью молекулярного клонирования и секвенирования подтверждено существование таких последоватнльностей ДНК с большим числом повторов, которые могут располагаться либо тандемно, либо изолированно друг от друга среди неродственных геномных локусов.
По скорости реассоциации ДНК эукариот разделяется на три фракции: быстро реассоциирующие (к ним относится высокоповторяющаяся или сателлитная ДНК), фракции со средней скоростью реассоциации (умеренно повторяющаяся ДНК) и медленно реассоциирующая ДНК (уникальные последовательности).
Фракция ДНК, включающая высокоповторяющиеся геномные последовательности, функционально и структурно обособленная часть генома, представленная сателлитными ДНК. В их составе имеются повторы из нескольких нуклеотидов. Главная повторяющаяся единица сателлитных ДНК называется базовой последовательностью и может состоять из 3 – 7 или даже из нескольких сотен нуклеотидов. К классу умеренно повторяющихся относят последовательности, представленные в геноме десятками и сотнями копий. К ним относятся семейства генов, построенные из сгруппированных тандемно повторяющихся копий. Это гены гистонов, тРНК и рРНК. В целом они составляют несколько процентов от всей геномной РНК. К ним также относятся мобильные генетические элементы (МГЭ) разной природы. На их долю приходится значительная часть генома – 10-20%.
Уникальные последовательности генома содержат не только гены, кодирующие белки, но и последовательности ДНК, расположенные между генами и интроны.
Геномы органелл.
Отличительная особенность клеток эукариот состоит в том, что часть генетической информации у них заключена в молекулах, находящихся вне хромосом, локализованных в ядрах. Существуют два типа таких цитоплазматических ДНК: один находится в митохондриях эукариот, другие – в хлоропластах зеленых растений и водорослей. Как и все цитоплазматические элементы, они наследуются по материнской линии, а не по законам Менделя.
Большинство белков, из которых построены функциональные и структурные компоненты митохондрий и хлоропластов, кодируются хромосомной ДНК, синтезируются на рибосомах в цитоплазме и транспортируются в соответствующие органеллы. Однако несколько белков кодируются неядерной ДНК и синтезируются на особых рибосомах органелл.
Многие митохондриальные геномы представляют собой замкнутые кольцевые сверхспиральные дуплексные ДНК. Митохондрии некоторых грибов и простейших имеют линейные геномы.
Геномы митохондрий существенно различаются по размеру. У животных они относительно малы и обычно не превышают 20 т.п.н. Однако дрожжевые митохондриальные ДНК состоят из примерно 80 т.п.н. Митохондриальные ДНК млекопитающих организованы весьма рационально, и между генами почти нет промежутков.
Митохондриальная ДНК эволюционирует гораздо быстрее, чем ядерная, и мутации в ней происходят в десять раз чаще. В результате возникает широкий внутривидовой полиморфизм. У млекопитающих большинство генов, кодирующих РНК или белки, разделены одним или более тРНК-генами. Промежутки между генами, как правило, не превышают 25 п.н. Обе цепи всего митохондриального генома транскрибируются с образованием одной молекулы РНК специфической митохондриальной РНК-полимеразой. Ни один из генов не содержит интронов.
Особенность трансляции у митохондрий состоит в использовании необычных кодонов для инициации и терминации трансляции, а также для кодирования некоторых аминокислот. Необычному генетическому коду соответствует специфическое семейство тРНК.
Еще одной необычной особенностью митохондриальных геномов является наличие рибонуклеотидов вместо дезоксирибонуклеотидов. Возможно, это остатки РНК-праймеров. Т.о. синтез митохондриальной ДНК некорректен.
Геном хлоропластов в чем-то сходен с геномом митохондрий. Он представляет собой кольцевую ДНК и имеет достаточно большую длину: как правило, 120-180 т.п.н. При этом каждый хлоропласт может содержать десятки копий хлоропластного генома. Структура ДНК хлоропластов в пределах вида остается довольно консервативной. Скорость эволюции кодирующих последовательностей хлоропластных генов значительно ниже скорости эволюции ядерных генов. Всего хлоропластная ДНК кодирует примерно 100 полипептидов и 35 РНК. ДНК хлоропластов использует универсальный генетический код. Гены содержат интроны.
Литература
1. Горбунова В.Н., Баранов В.С. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. СПб. Специальная литература. 1997. Стр. 43-69.
2. Коничев А.С., Севастьянов Г.А. Молекулярная биология. М. ACADEMIA. 2003. Стр. 135-146,156-167
3. Льюин Б. Гены. М. Мир. 1987. Стр.139-173, 188-205, 222-266, 280-288.
4. Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Молекулярная биология. М. Медицинское информационное агентство. 2003. Стр. 87-88, 95-107.
5. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии. Минск. Высшэйшая школа. 1986. Стр.10-24.
6. Сингер М., Берг П. Гены и геномы.М. Мир. 1998. Т.2. Стр. 20-146, 156-215, 216-237.
7. Спирин В.С. Молекулярная биология. М. Высшая школа. 1990. Стр. 185-195
Лекция 4.
Мобильные генетические элементы.
Вопросы.
1. Мобильные генетические элементы прокариот.
2. Мобильные генетические элементы эукариот.
3. Вирусы.
Изменчивость как эу-, так и прокариотических организмов связана не только с точечными мутациями, хромосомными перестройками или рекомбинационными событиями, но и с мобильными генетическими элементами (МГЭ) – сравнительно автономными сегментами ДНК, способными встраиваться в геном клетки-хозяина и вырезаться из него. К МГЭ можно отнести и некоторые вирусы – в этом случае возможно перемещение не только в пределах генетического материала одной клетки, но и между клетками.
1. Мобильные генетические элементы прокариот.
У бактерий перенос генетической информации между клетками могут осуществлять не только вирусы, но и плазмиды, многие из которых могут встраиваться в различные участки генома клетки-хозяина и поэтому тоже могут быть отнесены к МГЭ. Плазмиды – это двухцепочечные кольцевые ДНК размером от 5 до 0,1% размера хромосомы, несущие гены, не обязательные для клетки-хозяина, или гены, необходимые лишь в определенной среде. Для своей репликации плазмиды используют репликативную систему клетки-хозяина, однако репликация плазмид зачастую происходит независимо от хромосомы. Каждая плазмида является самостоятельным репликоном, сама контролирует собственную репликацию и поддерживается в клетке в определенном, характерном для нее числе копий.
Некоторые бактериальные плазмиды способны передаваться из одной клетки в другую, иногда даже в клетку другого вида.
Еще одним типом бактериальных МГЭ являются IS-элементы. Это сегменты ДНК, способные как целое перемещаться из одного участка локализации в другой. IS-элементы содержат лишь те гены, которые необходимы для их собственного перемещения – транспозиции. Кроме того, IS-элементы имеют особую последовательность на концах, как правило, инвертированные повторы. При встраивании в новую последовательность ДНК IS-элементы вызывают небольшую дупликацию.
Транспозонами называют сегменты ДНК, обладающие теми же свойствами, что и IS-элементы, но содержащие гены, не имеющие непосредственного отношения к транспозиции. Транспозоны могут нести гены устойчивости к антибиотикам, гены токсинов или гены дополнительных ферментов клеточного метаболизма. Транспозон может быть устроен также, как IS-элемент, но с дополнительным геном. Но часто два IS-элемента, оказавшиеся поблизости друг от друга, способны перемещаться вместе, одновременно перенося заключенный между ними сегмент ДНК. Таким образом, два расположенных рядом IS-элемента могут образовать транспозон.
Транспозоны и IS-элементы ответственны за целый ряд генетических явлений у бактерий. Встраивание МГЭ в какой-либо ген может привести к его инактивации. Кроме того, некоторые из них вызывают генетическую нестабильность поблизости от места своей локализации. МГЭ способны также вызывать транслокации, делеции и инверсии.
И плазмиды, и МГЭ обладают сравнительной автономией от основной массы генетического материала, и поэтому их можно рассматривать как своего рода организмы, обитающие в особой, генетической среде. Таким образом, плазмиды, IS-элементы и транспозоны можно рассматривать как «эгоистическую» ДНК, обеспечивающую в первую очередь собственное размножение. В этом смысле они непосредственно примыкают к вирусам, «эгоистические» тенденции которых очевидны.
Хотя многие свойства МГЭ и плазмид разумно рассматривать с точки зрения концепции эгоистичной ДНК, они играют существенную позитивную роль в жизни бактерий-хозяев, даже если они не приносят непосредственной пользы. Дело в том, что они служат важнейшими факторами генетической изменчивости и эволюции бактерий.
2. Мобильные генетические элементы эукариот.
Существенную часть генома эукариот (10-20%) составляют повторяющиеся последовательности ДНК (см. гл. II). Критерием для отнесения фрагментов генома к числу подвижных часто служит лишь локализация по их флангам коротких прямых повторов из нескольких пар нуклеотидов, появляющиеся в результате их транспозиции. Функциональная роль их неясна, но, во всяком случае, они в значительной степени определяют, как и у прокариот, изменчивость генома и, следовательно, могут играть большую роль в эволюции генома.
Многие спонтанные мутации эукариот обусловлены внедрением МГЭ. Частота таких перемещений невелика – 10-4 -10-5 в расчете на ген в одном поколении. Положение мобильного элемента может сохраняться неизменным в данном сайте генома, в таком случае их можно рассматривать как мобильные лишь в эволюционном масштабе времени. Однако в клетке могут возникать условия, определяемые как внутренними генетическими факторами, так и внешней средой, когда может резко увеличиться частота транспозиций. Это может приводить к существенным геномным перестройкам, которые могут сказываться на эволюционной судьбе организмов.
Выделяют ряд классов подвижных элементов эукариот на основе различий их молекулярной структуры и способности к перемещениям.
Существенная часть генома эукариот, особенно млекопитающих (до 10%), образовалась в результате интеграции в геном фрагментов ДНК, синтезированных на РНК-матрицах в результате обратной транскрипции. В геноме млекопитающих, птиц, амфибий и насекомых обнаруживаются ретропозоны, представляющие собой внедрившиеся в геном ДНК-копии, синтезированные на разных типах клеточных РНК как на матрицах. Таким образом, наряду с переносом информации от ДНК к РНК, осуществляется и обратный процесс – возвращение ее в геном в виде ретропозонов. К ретропозонам относятся и псевдогены – испорченные копии нормальных генов, лишенные регуляторных последовательностей и интронов, что говорит о том, что они были копией процессированной мРНК внедрившейся в геном. Псевдогены представлены в геноме разным числом копий, они ограничены короткими прямыми повторами, появившимися в результате их внедрения в ДНК.
Основная масса повторяющихся элементов позвоночных представленная огромным числом копий – десятками или сотнями тысяч, образовалась в результате ретропозиции ДНК-копий клеточных РНК, матрицами для которых послужили полиаденилированные РНК, кодирующие белки неизвестной природы, а также аномально процессированные клеточные транскрипты тРНК, 7SРНК и UРНК. Особенно богаты такими повторами геномы высших эукариот – млекопитающих.
Другой большой класс подвижных элементов составляют ретротранспозоны, сходные по своей структуре с проретровирусами, которые внедряются в геном, используя механизмы обратной транскрипции. Эти элементы содержат «тело» размером 5-8 т.п.н., ограниченное прямыми длинными концевыми повторами. Число копий таких элементов, принадлежащих к одному семейству, достаточно постоянно для вида, но варьирует от нескольких копий до сотен тысяч копий в зависимости от типа ретротранспозона. Ретротранспозоны обычно ведут себя как стабильно наследуемые гены, однако определенные воздействия окружающей среды могут индуцировать их перемещения.
Есть в геномах эукариот и подвижные элементы, сходные с транспозонами прокариот. Их отличительной особенностью является наличие инвертированных повторов на флангах. Примерами их могут служить Р-элементы дрозофилы и Ас-элементы кукурузы.
В целом МГЭ эукариот представляют собой чрезвычайно разнородную популяцию с самыми разными функциями. Однако существует представление о том, что они не несут никакой функции, т.е., как правило, не влияют на фенотип организма и размножаются в геноме лишь благодаря особенностям своей структуры, в результате чего они постепенно заселяют геном. Предполагается, что они составляют фракцию эгоистичной ДНК, размножение которой ограничивается естественным отбором.
3. Вирусы.
Некоторые вирусы в определенной степени также можно рассматривать как подвижные элементы, способные к самостоятельному существованию. Вирусная частица состоит из молекулы нуклеиновой кислоты, заключенной в белковую оболочку (капсид). У некоторых более сложных вирионов капсид окружен липидным бислоем с погруженными в него белками. После того как вирион проникает в клетку, он утрачивает белковую оболочку, и начинается направляемый вирусным геномом процесс образования новых вирусных частиц.
Вирусный геном может быть представлен молекулами ДНК или РНК, линейными либо кольцевыми. У разных ДНК-содержащих вирусов геном может иметь молекулы разных типов. Это кольцевые дву- и однонитевые молекулы, линейные двухнитевые. Геномы почти всех известных РНК-содержащих вирусов – это линейные молекулы, которые в среднем короче вирусных ДНК-геномов. Самые крупные могут достигать длины до 28 т.н. Известные двухнитевые РНК-геномы всегда сегментированы, т.е. состоят из нескольких разных молекул.
Одни вирусы, реплицируясь в хозяйских клетках, приводят к их гибели. Другие встраиваются в ДНК клетки-хозяина, трансформируя клетку, и постоянно присутствуют в таком виде в инфицированной клетке и в ее потомках.
Ретровирусы – это обширная группа вирусов, представители которой различаются как по биологическим свойствам, так и по морфологии. Тем не менее, их геномы имеют следующие общие черты. 1. Вирусная РНК – одноцепочечная молекула длиной до десяти тысяч нуклеотидов. 2. В молекулах РНК есть прямой концевой повтор длиной несколько десятков нуклеотидов. 3. В вирусной РНК записана информация для синтеза трех групп специфических белков: структурных белков сердцевины вириона, ферментативных белков, принимающих участие в обратной транскрипции и интеграции вирусного генома, и белков, входящих в состав наружной оболочки вируса.
Особый интерес представляют так называемые онкогенные вирусы. Это РНК-содержащие ретровирусы. Геном многих онкогенных вирусов содержит сегменты, отличные от обычных вирусных генов. Эти сегменты представляют собой модифицированные клеточные гены, которые обуславливают способность многих ретровирусов индуцировать образование опухолей. Они называются вирусными онкогенами (v-onc). Каждый v-onc кодирует белки, которые в том случае, когда они синтезируются в клетке, обусловливают ее опухолевый фенотип. Нормальные клеточные гены, от которых произошли v-onc, называются протоонкогенами. Обычно протоонкогены не приводят к образованию раковых клеток. Другое дело, если при включении в вирусный геном происходит их модификация.
Литература.
1. Коничев А.С., Севастьянов Г.А. Молекулярная биология. М. ACADEMIA. 2003. Стр. 115-133.
2. Льюин Б. Гены. М. Мир. 1987. Стр.457-472, 473-489, 490-502.
3. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии. Минск. Высшэйшая школа. 1986. Стр.24-57
4. Сингер М., Берг П. Гены и геномы.М. Мир. 1998. Т.2. Стр. 227-230, 230-269.
5. Спирин В.С. Молекулярная биология. М. Высшая школа. 1990. Стр. 110-129, 221-233, 260-332.
Лекция IV.
Ферменты.
Вопросы.
1. Полимеразы
2. Нуклеазы
3. Другие ферменты.
Основная роль в функционировании нуклеиновых кислот принадлежит ферментам. В зависимости от выполняемых функций ферменты делятся на ряд групп.
1. Полимеразы. ДНК-полимераза осуществляет копирование матрицы в процессе репликации. Первый фермент этого типа был открыт в 1956 г. ДНК-полимеразы ведут синтез ДНК на одноцепочечной матрице, если имеется затравка – комплементарный матрице фрагмент растущей цепи. ДНК-полимеразы последовательно наращивают конец затравки, присоединяя к нему следующие нуклеотиды по принципу комплементарности. Для того, чтобы обеспечить высокую точность наряду с высокой скоростью репликации, природе пришлось прибегнуть к специальным механизмам, один из которых – механизм коррекции.
ДНК-полимеразы проверяют комплементарность каждого нуклеотида дважды: один раз перед включением его в состав растущей цепи и второй раз перед тем, как включить следующий нуклеотид. Очередной нуклеотид присоединяется лишь в том случае, если последний нуклеотид затравки комплементарен матрице. Если же на предыдущей стадии произошла ошибка, то репликация останавливается до тех пор, пока неправильный нуклеотид не будет удален. Т.о. ДНК-полимеразы не способны инициировать новые цепи, они могут лишь достраивать уже имеющуюся затравку.
Новосинтезированные цепи ДНК всегда содержат на 5'-конце несколько рибонуклеотидов, т.е. синтезДНК начинается с синтеза РНК. РНК-затравку для синтеза ДНК образует специальный фермент, называемый праймазой . Праймаза может быть отдельным ферментом или входить в качестве субъединицы в ДНК-полимеразу.
Транскрипцию генов рРНК, тРНК и большинства генов, кодирующих белки, обеспечивают молекулы РНК-полимеразы. У прокариот имеется только одна РНК-полимераза, а у эукариот – три разных РНК-полимеразы в соответствие с тремя классами генов (см. гл. II). РНК-полимеразы – это сложные молекулы, состоящие из нескольких субъединиц. Наибольшей сложностью отличаются эукариотические РНК-полимеразы. Особые РНК-полимеразы обеспечивают транскрипцию клеточных органелл эукариот – митохондрий и хлоропластов.
Обратные транскриптазы (РНК-зависимые ДНК-полимеразы). Эти ферменты были выделены из РНК-содержащих опухолеродных вирусов. Они позволяют синтезировать ДНК на РНК-матрице. Реакция, катализируемая обратными транскриптазами, аналогична стандартным реакциям с участием ДНК-полимераз и нуждается в затравке. В качестве матрицы обычно используется одна цепь РНК, на которой синтезируется комплементарная цепь ДНК. В результате образуется гибридная молекула ДНК-РНК.
Терминальная трансфераза. Катализирует синтез одноцепочечной ДНК. Подобно ДНК-полимеразам, она не способна инициировать синтез новой цепи и нуждается в затравке. Однако в отличие от истинных ДНК-полимераз она не нуждается в матрице и не способна что-либо копировать вообще. Продукт полимеризации соответствует использованному субстрату. Продуктом ее синтеза является одноцепочечный полимер.
Poly(A)-полимераза подобно терминальной трансферазе присоединяет нуклеотидные остатки к 3'-концу цепи без участия матрицы. Однако она проявляет специфичность в отношении РНК. Субстратом является только АТФ.
Теломераза. Этот фермент может строить теломеры, при этом родительская ДНК не используется в качестве матрицы Теломераза – это крупный рибонуклеопротеиновый комплекс; для проявления ферментативной активности необходимы как РНК, так и белки. Теломеразная РНК служит матрицей для синтеза ДНК теломер. Белковый компонент выступает как обратная транскриптаза.
2. Нуклеазы. Эти ферменты позволяют специфическим образом модифицировать молекулы ДНК и РНК и расщеплять их. Нуклеазы специфичны в отношении субстрата, могут действовать и на одноцепочечные, и на двухцепочечные молекулы. Нуклеазы делятся на экзонуклеазы и эндонуклеазы. Экзонуклеазы расщепляют полинуклеотидные субстраты, имеющие свободные концы. Эндонуклеазам свободные концы не требуются, поэтому данные ферменты могут гидролизовать кольцевые молекулы. Разрезание осуществляется по внутренним фосфодиэфирным связям, при этом образуются фрагменты разной длины.
3. Лигазы производят ковалентное сшивание молекул ДНК и\или РНК, катализируя образование фосфодиэфирных связей. ДНК-лигаза фага Т4 способна сшивать и двухцепочечные молекулы.
ДНК-топоизомеразы – эти ферменты изменяют степень сверхспирализации и тип сверхспирали. Они создают условия для непрерывного движения репликативной вилки, обеспечивают разделение сцепленных кольцевых ДНК и устранение узлов и спутанных клубков из длинной линейной ДНК путем внесения одноцепочечного разрыва. Топоизомеразы являются также неотъемлемыми участниками некоторых рекомбинационных процессов. Топоизомеразы надрезают одну из двух цепей, в результате чего фланкирующие дуплексные области могут повернуться вокруг интактной цепи, и затем воссоединяют концы разрезанной цепи. Эта реакция не требует энергии АТФ. Одиночная цепь спонтанно проходит через разрез.
Литература.
1. Коничев А.С., Севастьянов Г.А. Молекулярная биология. М. ACADEMIA. 2003. Стр. 95-99, 205-213.
2. Льюин Б. Гены. М. Мир. 1987. Стр.132-138, 409-431.
3. Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Молекулярная биология. М. Медицинское информационное агентство. 2003. Стр. 23-27, 32-41.
4. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии. Минск. Высшэйшая школа. 1986. Стр.64-69.
5. Сингер М., Берг П. Гены и геномы.М. Мир. 1998. Т.1. Стр. 211-218, 222-227.
6. Спирин В.С. Молекулярная биология. М. Высшая школа. 1990. Стр. 44-51, 129-135.
Лекция V.
Репликация.
Вопросы
1. Общая характеристика процесса репликации.
2. Схема процесса репликации.
3. Процесс репликации у про- и эукариот.