Главная | Обратная связь

Векторы для клонирования больших фрагментов ДНК

Фаговые векторы

Напомним, что фаговые векторы конструируют на базе ДНК фагов с таким расчетом, чтобы в них сохранилась информация, которая обеспечивает сборку in vivo фаговых частиц. Для клонирования в клетках Е. coli такие векторы разработаны на базе ДНК фагов λи M13. В первом случае фаговые головки имеют строго определенную геометрию, так что векторы способны включать та­кое количество чужДНК, чтобы образовавшиеся рекДНК могли упаковаться в головки фага. По этой причине векторы характери­зуются своей емкостью. Для нитевидных фагов, к которым отно­сится М13, понятие емкости не применимо, величина клонируе­мой в них ДНК определяется требованиями эксперимента к стабильности фаговых частиц.

Векторы, сконструированные на основе ДНК фага λ. Фагу λ самой природой была уготована роль переносчика чужих генов in vivo и in vitro. Действительно, в середине его генома имеется область, несущественная для развития фага. Она замещается на бактериальные гены при образовании трансдуцирующих фагов и она же используется для внедре­ния чужДНК в вектор методами in vitro.

Фаговые векторы подразделяются на векторы внедре­ния и векторы замещения. Первые несут один сайт узнавания для избранной рестриктазы, поэтому у них, как и у плазмидных векторов, длина рекДНК равна сумме длин вектора и клонируемого фрагмента. Векторы замещения имеют два сайта узнавания для используемой рестриктазы, поэтому в такие векто­ры клонируемые фрагменты ДНК вставляют вместо участков, ог­раниченных данными сайтами. В обоих случаях в реакциях обра­зования рекДНК участвуют два фрагмента λ ДНК (левое и правое плечи векторного генома, имеющие на одном из своих концов соs-сайт) и фрагмент чужДНК. Под действием лигазы благодаря соs-сайтам прежде всего объединяются разные плечи λ ДНК. За­тем образовавшиеся векторные молекулы реагируют с чужДНК и друг с другом, формируя конкатемеры. Они являются субстратом при сборке фаговых частиц in vitro.

Емкость фагового вектора, т.е. теоретически наи­больший размер чужДНК, вставляемой в него, вычисляется как разность между максимальной величиной молекулы ДНК, упа­ковываемой в головку фага λ, (она равняется 52 т.п.н.), и мини­мальной величиной генома фага, необходимой для его развития. Последняя, в свою очередь, подсчитывается как разность между длиной ДНК (48,5 т.п.н.) и суммарной длиной областей, несуще­ственных для развития фага. К ним относится область в центре генома между генами J и N размером 16 т.п.н. и область nin меж­ду генами Р и Qразмером 3,5 т.п.н. Таким образом, минимально возможный размер векторов, сконструированных на основе λ ДНК, 29 т.п.н. (48,5 - 16 - 3,5), а максимальная величина вставки (тео­ретическая емкость) 23 т.п.н. (52 - 29).

Реальная емкость вектора определяется не только его разме­ром, но и минимальной величиной ДНК, которая может упако­ваться в фаговую головку (36 т.п.н.). Поэтому вводятся понятия максимальной и минимальной емкости фаговых векторов. Под этими понятиями подразумевается максимальное и минимальное количество ДНК, которое можно клонировать в векторе. Эти ве­личины определяются как разность, соответственно, между макси­мальным или минимальным размером упаковываемой ДНК и сум­марным размером плеч вектора. Например, если у вектора сумма плеч равна 34 т.п.н., то в нем можно клонировать фрагменты ДНК размером от 2 (минимальная емкость) до 18 т.п.н. (максимальная емкость). Отметим, что если в последнем примере вектор является вектором внедрения, то он не образует жизнеспособных фагов, а рекДНК, сделанная на его основе, образует. Это обстоятельство можно использовать как фактор прямой селекции рекомбинантных фагов, несущих вставки чужДНК.

Отбор фагов, содержащих только рекДНК, ведут методом пря­мой или непрямой селекции.

Стратегию конструирования фаговых векторов мож­но рассмотреть на примере создания первых векторов, предназначенных для работы с рестриктазой EcoRl. В ДНК фага λ дикого типа имеется 5 EcoRI-сайтов, причем три из них располагаются в центральной области, где локализованы несу­щественные гены, а два сайта затрагивают важные гены. Конечно, сайты рестрикции, используемые для клонирования, не должны затрагивать существенные гены. Поэтому авторы отобрали жизнеспособные варианты фагов, у которых два последних сайта были изменены. На их основе были созданы векторы серии λgt (general transduction), причем для увеличения их емкости в них была внесена делеция nin5 размером 2,8 т.п.н.

В базовой конструкции λgt отсутствуют центральные фрагмен­ты В (4,8 т.п.н.) и С (5,5 т.п.н.), поэтому ее, казалось бы, можно было использовать как вектор внедрения. Размер такого вектора (48,5 -2,8 - 4,8 - 5,5 = 35,4 т.п.н.) был бы недостаточен для упаковки в фаговую головку, что давало бы возможность прямого отбора рекДНК в виде фаговых частиц. Однако на практике подобные векторы мож­но использовать, если только предлагаются способы наработки их ДНК. Известны два таких способа — внедрение в вектор плазмидного репликатора или буферных фраг­ментов, увеличивающих его до размеров, которые обеспечивают упа­ковку вектора в головку фага.

Кроме векторов, приспособленных для работы с рестриктазой EcoRI, во второй половине семидесятых годов были созданы векторы и для многих других рестриктаз. Принципы их конструирования сходны с вышеописанными. Например, широкое распространение получили векторы-хароны, на­званные так по имени мифического перевозчика через реку Стикс. Для удаления из правого плеча харонов нежелательных сайтов рест­рикции были использованы аналогичные по функциям участки ДНК других лямбдоидных фагов, а также различные делеции. В централь­ной части замещения, делеции, дупликации и вставки подбирались так, чтобы ввести в векторы нужные сайты рестрикции. В результате с помощью полученных векторов можно клонировать фрагменты ДНК разной длины, используя при этом различные рестриктазы. Всего было сконструировано несколько десятков харонов.

Более универсальны благодаря сайтам поликлонирования векторы λ2001 и λDASH, которые также предназначены для конструирования геномных библиотек. Их емкость 10—22 т.п.н. Промоторы фагов Т3 и Т7, имеющиеся на концах полилинкеров у вектора λDASH, позво­ляют транскрибировать любую из нитей встроенного фрагмента ДНК. Полученные транскрипты можно использовать для "прогу­лок по хромосоме" с целью генетического картирова­ния. Отбор рекомбинантных фагов ведут по Spi^- фенотипу, ис­пользуя рекомендуемый штамм NM539.

Векторы, созданные на базе ДНК нитевидных фагов. Близко­родственные нитевидные колифаги М13, fl и fd обладают однонитевой кольцевой ДНК, состоящей из 6,4 тыс. нуклеотидов, и име­ют ряд свойств, позволяющих использовать их в качестве векторов. Во-первых, в их ДНК между генами II и IV есть межгенный участок (спейсер), в который можно вставлять чужеродные гены. Во-вторых, размер капсиды зависит от длины упа­ковываемой молекулы ДНК, что позволяет клонировать фрагмен­ты ДНК размером до 15 тыс. нуклеотидов. В-третьих, они образуют фаголизаты с высокой концентрацией (до 10¹² частиц в 1 мл) и, таким образом, позволяют получать большие количества вектор­ной и клонируемой ДНК.

Преимущества однонитевых векторов являются следствием особенностей развития нитевидных фагов. Генно-инженерные операции с однонитевыми векторами и процедуры по их конструированию ведутся, конечно, с использо­ванием двунитевых репликативных форм (РФ) ДНК. Создание подобных векторов сводится к введению в спейсеры единичных сайтов рестрикции, а также селективных маркеров. Основная осо­бенность этих векторов — возможность работать с ними и как с плазмидами, используя РФ ДНК, и как с фагами. Доступность клонируемых генов сразу в одно- и двунитевой формах значи­тельно облегчает их структурный и функциональный анализ. По­лучение клонированных генов в однонитевой форме необходимо для секвенирования генов по Сэнгеру, для сайт-специфического мутагенеза и для приготовления гибридизационных зон­дов. Главный недостаток однонитевых векторов — нестабильность клонируемых в них чужДНК, обусловленная тем, что фаги с боль­шими вставками развиваются медленнее. Поэтому уменьшение их длины является фактором селекции.

Широкое распространение получили векторы серии М13mр, созданные в 1977—1983 годах в лаборатории Мессинга, в которых селективным признаком для отличия вектора от рекДНК служит фенотип Lac⁺ или Lас^-трансфицированных клеток.

Введение в бактерии векторов типа М13mр осуществляют трансфекцией клеток Е. coli кальциевым методом, причем двунитевая ДНК трансфицирует более эффективно, чем однонитевая. Клетки, инфицированные нитевидными фагами, продолжают де­литься, поэтому из негативных колоний можно выделять жизне­способные клетки, содержащие фаги.

Гибридные векторы

К гибридным векторам условно относят векторы, которые сочетают в себе все или отдельные свойства плазмидных и фаговых векторов.

Фагмиды. Фагмидами называют плазмидные векторы, содер­жащие ori-сайтнитевидных фагов. Из векторов этого типа наибо­лее часто используются плазмиды серии pEMBL, pUC118/119 и Bluescript M13. Они образованы внедрением в векторы pUC фрагмента ДНК фага f1 или М13, содержащего сайт рас, необходимый для морфогенеза фаговых частиц, и сайты ori(+) и ori(-). В присутствии фага-помощника fl (или М13) фагмиды, ис­пользуя сайт ori(+), начинают реплицироваться как фаговые ДНК, образуя однонитевые копии плазмид, причем выбор нити для ко­пирования зависит от ориентации ori-сайта. Образовавшиеся од­нонитевые ДНК могут упаковываться in vivo в капсулу и одновре­менно с фагом-помощником покидать естественным путем клетку.

Таким образом, с помощью фагмид клонируемый фрагмент может быть получен и использован в одно- или двунитевой фор­ме. Их преимущество перед векторами М13mр — возможность клонирования в них относительно больших фрагментов ДНК (до 10 т.п.н.), не подвергающихся внутренним перестройкам.

Космиды. Как уже отмечалось, емкость векторов, получен­ных на базе ДНК фага λ (не более 23 т.п.н.), ограничена тем, что существенную их часть составляют гены, кодирующие структур­ные белки фага. Как выяснилось, в головку этого фага может упаковаться любая ДНК подходящего размера (36—52 т.п.н.), ог­раниченная двумя cos-сайтами, ориентированными в одном на­правлении. Это позволило, совместив в одном геноме плазмидный репликатор и cos-сайт фага λ, создать векторы нового типа, так называемые космиды. Размер космид в сред­нем составляет 5 т.п.н., что позволяет с их помощью клонировать ДНК размером до 45-47 т.п.н. Поэтому космиды предназначены для конструирования банков генов.

Космиды фактически представляют собой автономные cos-сайты. Использование их для клонирования генов основано на том, что в линеаризованной форме они могут присоединяться к обоим концам фрагментов чужДНК и образовывать структуры типа конкатемерных молекул ДНК. Такие молекулы способны упако­вываться in vitro в головки фага λ, если, конечно, cos-сайты нахо­дятся в одинаковой ориентации и размер ДНК между ними не превышает 52 т.п.н. Инъецированные в клетки рекомбинантные молекулы ДНК циркуляризуются через cos-сайты и автономно реплицируются. В присутствии фага-помощника они могут быть упакованы in vivo в фаговые головки и после лизиса клеток ото­браны в виде фаговых частиц.

Обычно космиды конструируют на базе плазмиды pBR322. Тех­ника клонирования генов с их помощью заключается в следующем. Космиду линеаризуют рестриктазой через сайт клонирования и смешивают ее с чужДНК, подвергнутой частичному гидролизу с помощью рестриктазы, образующей одинаковые липкие концы с вектором. В результате образуются продукты разного строения. Из них к упаковке способны только такие фрагменты чужДНК, которые несут на обоих концах космиды, находящиеся в одной ориентации. Следовательно, уже на этапе упаковки осу­ществляется отбор рекДНК. Реконструированными in vitro фагами инфицируют бактериальные клетки, а клоны, содержащие рекомбинантные космиды, отбирают по селективным маркерам. При этом образуется в среднем 10⁶ клонов из 1 мкг чужДНК. Несмот­ря на мультикопийность исходных космид, число копий рекомбинантных космид на клетку не превышает нескольких единиц. По­этому содержащие их бактериальные клоны необходимo поддерживать в селективных условиях. Главные преимущества космид: 1) передача рекДНК в клет­ки инфицированием гораздо эффективнее, чем трансформацией; 2) в инфицированные клетки проникают в основном рекомбинантные молекулы ДНК; 3) происходит селекция больших кло­нируемых фрагментов (30—45 т.п.н.), в то время как при транс­формации отбираются главным образом плазмиды меньшего размера. Последнее особенно важно при создании банка генов и при необходимости клонировать и анализировать эукариотические гены больших размеров.

Однако космидам присущи и серьезные недостатки. Первый — возможность объединения в одной рекомбинантной космиде двух или более фрагментов чужДНК, не располагающихся рядом в ис­ходном геноме, что затрудняет правильную интерпретацию выво­дов о структуре генов. Во избежание этого перед клонированием необходимо дефосфорилировать фрагменты чужДНК и/или ото­брать фракцию размером 30—45 т.п.н. Первый способ делает не­возможным объединение фрагментов ДНК друг с другом, а второй препятствует упаковке слишком больших рекомбинантных космид. Другой недостаток — нестабильность рекомбинантных космид, причем внутримолекулярные делеции образуются даже в rесА^- штаммах. Он устраняется использованием клеток Е. coli recBCsbcBrecJ. Наконец, наблюдается сравнительно высокий фон мультимерных векторных молекул, который затрудняет поиск рекомбинантных клонов. И в этом случае рекомендуется дефосфо­рилировать линеаризованные космиды, что предотвратит их объе­динение. Однако, требуются специальные методы, чтобы лигировать вектор и чужДНК, если оба компонента дефосфорилированы.

Современные космиды имеют полилинкеры, по краям кото­рых расположены сайты для редкощепящих рестриктаз с целью "вырезания" клонированных фрагментов, или фаговые промоторы с целью получения транскриптов с концевых участков вставок. Транскрипты используют в качестве зондов в методе "прогулки по хромосоме". Сконструированы также космиды, со­держащие эукариотические ori-сайты и селективные маркеры; они предназначены для работы с клетками животных. От­метим, однако, что в связи с техническими трудностями космиды применяют все реже.

Фазмиды. О природных фазмидах, сочетающих в себе свой­ства фагов и плазмид, уже упоминалось. В фазмидных векторах искусно сочетаются положительные свойства фаговых и плазмидных векторов. Один из первых таких векторов — фазмида λpMYF131. Размер фаз­миды (33,3 т.п.н.) не допускает ее упаковки в головку фага λ, поэтому для наработки векторной ДНК используют плазмидный репликатор, а само это свойство применяют для отбора рекомбинантных фазмид в виде фаговых частиц, реконструированных in vitro. Емкость вектора λpMYF131 — 4,4-19,6 т.п.н., что позво­ляет привлекать его для получения банков генов. Выход рекДНК достигает 3х10⁶ фаговых клонов на 1 мкг векторной ДНК. Рекомбинантные фазмиды можно отбирать и в составе бактериальных клонов, инфицируя ими λ-лизогены и отбирая трансдуктанты на среде с ампициллином.

Фазмидные векторы так же как и фаговые, используют для клонирования кДНК и геномной ДНК. Эффективность упаковки рекомбинантных фазмид в фаговую головку с последующим инфицированием клеток Е. coli превосходит эффективность транс­формации бактерий плазмидами в 100 раз. Это существенно об­легчает конструирование банков генов, содержащих до миллиона независимых клонов, повышая тем самым вероятность изолирова­ния редких клонов. И сам процесс скрининга в данном случае также существенно облегчен, так как рассев фагов на чашки мо­жет проводиться с высокой плотностью, а фон "ложных ответов" обычно мал. Однако большой размер фаговых и фазмидных векторов затрудняет рестрикционный анализ клони­рованных генов и их секвенирование, так что после нахождения нужного клона вставку, как правило, переносят в плазмидный вектор. Эта процедура методами in vitro отнимает много времени. От нее избавляет оригинальный фазмидный вектор λZAP, который обладает уникальной способностью исключать in vivo содержащуюся в нем плазмиду вместе с клони­рованными генами. Он используется главным образом для клонирования и эксп­рессии кДНК.

Векторы для клонирования больших фрагментов ДНК

Клонирование больших (50—100 т.п.н. и более) фрагментов ДНК — важная проблема, поскольку при этом, во-первых, суще­ственно облегчается создание геномных библиотек, а, во-вторых, удается провести функциональный анализ полных больших генов или их комплексов. Действительно, многие гены эукариот состоят из нескольких сотен т.п.н., а своеобразным рекордсменом является ген дистрофина, чья транскрибируемая область превышает 2 млн.п.н. Поэтому в последнее десятилетие были предприняты усилия по конструированию емких векторов. Сначала проблема была ре­шена для дрожжевых клеток созданием искусственных хромосом YAC. Затем такие векторы были созданы на базе ДНК плазмидных профагов Р1 (РАС — PI artificial chromosome) и N15 (NAC — N15 artificial chromosome), а также F-плазмиды (ВАС — bacterial artificial chromosome). Векторы рРАС и pNAC позволяют клонировать сверхкрупные, а рВАС — гигантские фрагменты ДНК. Уточним, что названия YAC, РАС, ВАС и т. д. применя­ют для рекДНК, а сами векторы обозначают pYAC, рРАС и рВАС.

Векторы pNAC — пока единственные линейные прокариотические векторы. При клонировании больших фрагментов ДНК линейные векторы обладают преимуществом перед кольцевыми векторами, так как эффективность образования рекДНК в этом случае выше. В то же время следует учитывать, что в процедурах выделения большие линейные молекулы ДНК более ломки, чем кольцевые. Отметим важную особенность репликонов, использованных для создания вышеупомянутых векторов: все они малокопийны. Это вызвано необходимостью обеспечить стабильность клонируе­мой ДНК. Известно, что с увеличением ее размера увеличивается вероятность ее структурных перестроек (делеции, вставки, инвер­сии). Вероятность повышается по мере увеличения числа копий рекДНК, поскольку все более сказывается эффект межмолекуляр­ной рекомбинации.