 |
|
Напишите принцип метода «Полимеразная цепная реакция (ПЦР)»________________
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Заполните таблицу, указывая роль компонентов реакции ПЦР:
| Компонент ПЦР | Роль компонента в реакции | |
| ДНК-матрица | ||
| Праймеры | ||
| Термостабильная ДНК-полимераза (Taq, Pfu, Pwo) | ||
| Дезоксинуклеотидтрифосфаты | ||
| Ионы Mg2+ | ||
| Буферный раствор | ||
| Минеральное масло |
Опишите этапы амплификации для выделения нуклеиновых кислот методом ПЦР:
| Температура | Время | Результат | ||
| 1 цикл амплификации | Денатурация | |||
| Отжиг праймеров | ||||
| Синтез цепи ДНК | ||||
| Укажите возможное количество циклов амплификации: | ||||
| Результат амплификации: |
Перечислите достоинства метода ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний:
1._________________________________________________________________2._________________________________________________________________3._________________________________________________________________4._____________________________________________________________
Перечислите недостатки метода ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний:
1._________________________________________________________________2._________________________________________________________________3._________________________________________________________________4._____________________________________________________________
Задания, выполняемые в ходе практической части занятия:
Провести диагностику хеликобактериоза (Helicobacter pylori) с помощью комплекта реагентов для ПЦР-амплификации ДНК с детекцией в режиме реального времени (формат «Real-time) на приборе ДТ-96 (НПО ДНК-Технология).
Ход исследования:
1. Взятие клинического образца. Каждый обучающийся берет зубной налет, для чего стерильной зубочисткой счищает налет в щели между зубами и с поверхности зубов.
2. Поместить конец зубочистки с зубным налетом в пробирку с транспортной средой и обломать ее так, чтобы конец зубочистки был такого размера, чтобы Вы могли свободно закрыть пробирку крышкой.
3. Пронумеровать пробирки в соответствии с указаниями преподавателя и сдать их в учебный отдел для проведения пробоподготовки и амплификации.
4. Этап пробоподготовки (или выделения нуклеиновых кислот). Клетки микроорганизмов из анализируемой пробы лизируют для высвобождения содержащихся в них нуклеиновых кислот Helicobacter pylori. При необходимости проводят дополнительный этап отделения клеток перед лизисом и/или этап очистки после него. Лизис клеток осуществляют путем добавления лизирующего раствора (гуанидина).
5. Амплификация. В пробирку со смесью для амплификации добавить 10мкл раствора Taq-полимеразы и 1 каплю минерального масла. Добавить 5,0 мкл выделенного образца препарата ДНК. В пробирку «К-» добавить 5,0 мкл отрицательного контрольного образца, в пробирку «К+» добавить 5,0 мкл положительного контрольного образца. Пробирки центрифугировать при 1000об/мин в течение 3-5 с.
6. Установите пробирки в детектирующий амплификатор ДТ-96 и провести ПЦР в режиме реального времени в соответствии с программой, указанной в таблице №1.
Таблица1
Программа амплификации для выделения нуклеиновых кислот
Helicobacter pylori на приборе ДТ-96
| № блока | Тип блока | Температура, оС | мин | сек | Количество циклов | Режим оптических измерений |
| цикл | ||||||
| цикл | ||||||
| ٧ | ||||||
| цикл | ||||||
| ٧ | ||||||
| хранение |
7. Расшифруйте результаты анализа. Сделайте вывод.