 |
|
Выращивание и хранение клубеньковых бактерий
Для выращивания клубеньковых бактерий, как уже отмечалось, используют растительнные экстракты. Как правило, такие экстракты дополнительно обогащают сахарами или маннитом.
Быстрорастущие клубеньковые бактерии (БКБ) размножают и хранят в среде (г/л):
Гороховый отвар готовят следующим образом: 100 г гороха тщательно промывают и заливают 1 л водопроводной воды, кипятят 30—40 мин, фильтруют и доводят до 1 л. Затем добавляют сахарозу, агар и стерилизуют при (0,8—1,0)- 10Г| Па (0,8— 1,0 атм) в течение 30 мин.
Для медленнорастущих клубеньковых бактерий (МКБ) среды готовят аналогичным образом, но в качестве дополнительного источника углерода используют маннит, глюкозу или смесь сахарозы с глюкозой (1:1). Пробирки со скошенным агаром засевают соответствующим штаммом и выдерживают при 28—3O0C 4— 10 сут. Выросшие культуры хранят в холодильнике (3—50C) и по мере необходимости используют для приготовления рабочей культуры (пробирки).
Получение жидкой культуры (инокулята)
Жидкую культуру клубеньковых бактерий получают выращиванием в качалочных колбах или 5-литровых бутылях. Колба объемом 750 мл содержит 200 мл среды, бутыль — 2 л. Среда состоит из отвара гороха, фасоли или безалколоидного люпина (готовится, как описано выше), в которую добавляют глюкозу (для МКБ) или сахарозу (для БКБ). Среда готовится на водном растворе солей (г/л): (NH4HSO,, —- 0,5, KH2PO4 — 0,5; K2HPO4- 3H2O-0,5; MgSO4« 7Н2О—0,2; CaCO3 (стерильный)— 1,0; значение pH после стерилизации для БКБ 6,8—7,0, для МКБ 6,3—6,5. Для БКБ отвар гороха можно заменять кукурузным экстрактом — 7—10 г/л. Его предварительно разбавляют водой в 2—5 раз, выдерживают 18—24 ч при 35—370C и стерилизуют при давлении 2 • К)5 Па (2 атм) 1 ч. Мел также стерилизуют при этом режиме и добавляют его навеску после доведения значения pH в среде.
Бактериями с одного косяка засевают одну колбу. Бутыль засевается 3—5% жидкой культуры, полученной в колбе. Время выращивания для БКБ 48 ч, для МКБ 72—96 ч. При правильно выполненном режиме культивирования в колбах и бутылях получают по 8—15 млрд. клеток в 1 мл.
При выращивании клубеньковых бактерий в ферментере используют указанные выше рабочие среды; можно исключить приготовление отвара бобовых, загружая ферментер соответствующим количеством муки гороха. БКБ в ферментере выращивают 24—36 ч при аэрации 0,7—1,5 об/об/мин; МКБ культивируют 36—48 ч при аэрации 0,3—1,0 об/об/мин. Температура 28—3O0C Интенсивность аэрации определяется типом ферментера и особенностями штамма бактерий. В ферментер необходимо добавление пеногасителя. Получают титры клубеньковых бактерий не менее 5 млрд/мл. В случае получения более высоких титров допускается разбавление культуры холодной стерильной водой до плотности клеток 5 млрд/мл. Полученную таким образом культуру охлаждают до 10—150C и используют для инокуляции торфа.
Подготовка торфа
Для производства ризоторфина используют преимущественно кислые или слабокислые торфа (pH 3,0—6,0). Нейтральные и слабощелочные торфа подходят в меньшей степени из-за высокой контаминации и накопления в них метаболитов микроорганизмов, которые не всегда разрушаются при стерилизации и могут ингибировать рост клубеньковых бактерий. Наиболее подходящими являются древесно-осоковые и осоковые торфа. Отсутствие методов предварительной экспресс-оценки пригодности торфов для производства ризоторфина вынуждает, как уже отмечалось выше, использовать «биологическую» пробу — изготовленние препаратов на испытуемом торфе и хранение такого препарата в течение 3—6 месяцев (с подсчетом числа клубеньковых бактерий).