Здавалка
Главная | Обратная связь

Заготовка гипофизов



 

 

Гипофизы лучше всего заготавливать весной, в период хода

производителей. В это время половые продукты рыб находятся в IV завершенной стадии, и в гипофизах накапливается максимальное количество гормонов.

Заготавливать гипофизы от отнерестившихся рыб нельзя, поскольку


ранее содержавшиеся в них гормоны в период размножения полностью

расходуются. Нельзя использовать для заготовки и гипофизы от неполовозрелых рыб. Вместе с тем Т.И. Фалеева отмечает, что гипофизы можно заготавливать осенью и зимой.

Для извлечения гипофиза вскрывают череп живой или свежей рыбы трепаном, сделанным из стали и представляющим собой металлический стержень, снабженный рукояткой. На нижний конец стержня насажен цилиндр, который можно передвигать по вертикали вдоль стержня и закреплять при помощи винта.

У основания цилиндра имеются наточенные и разведенные зубцы, врезающиеся в ткань при вращении трепана. Его диаметр равен 30 мм. Для получения гипофиза от белуги применяют трепаны больших размеров диаметром 35—40 мм.

Трепан устанавливают посередине головы рыбы, позади глаз (Рис. 21). Для точной установки трепана цилиндр поднимают вверх до отказа, вследствие чего нижний заостренный конец стержня выдвигается за край цилиндра.

 

Рис. 21 Место взятия гипофиза (окружено жирной пунктирной линией позади глаз) у осетра

(по Т. И. Фалеевой).

 

 

После этого вращают рукоятку и, сделав несколько оборотов,

приподнимают стержень во избежание разрушения гипофиза. Затем трепан ввинчивают до отказа и вырезанную пробку, состоящую из кости и хряща, удаляют. В черепной крышке образуется отверстие, которое при правильной установке трепана, находится над гипофизарной ямкой.

Для получения гипофизов используют также электротрепан, представляющий собой электрическую дрель, что намного облегчает и ускоряет заготовку гипофизов.

Из полости черепа удаляют мозг и жидкость. Подготовительные

операции на этом заканчиваются и можно приступать к извлечению гипофиза.

Гипофиз извлекают применяемой в хирургии ложкой Фолькмана, имеющей острые края и длинную ручку. Ни в коем случае нельзя брать

 


пинцетом ткань железы, так как можно разрушить гипофиз и сделать его

непригодным для инъецирования.

С помощью ложки Фолькмана гипофиз легко можно вынуть и перенести в сосуд. Извлеченный гипофиз обезжиривают и обезвоживают, для чего в сосуд с хорошо закрывающейся крышкой (бюкс) наливают ацетон. После извлечения каждого гипофиза заготовитель помещает его в ацетон.

После того как все гипофизы извлечены, их помещают в новую порцию ацетона на 12 ч, затем его еще раз сливают и наливают новую порцию, в которой через 6—8 ч происходит обезжиривание. Извлеченные из бюкса гипофизы просушивают на фильтровальной бумаге.

Для обработки гипофизов можно применять только безводный, химически чистый ацетон. Объем ацетона должен в 10— 15 раз превышать массу заложенных в него гипофизов. Повторное использование насыщенного водой ацетона недопустимо.

Для длительного хранения высушенные гипофизы помещают в полиэтиленовые мешочки и этикетируют.

Желательно в отдельные мешочки подбирать гипофизы одной массы с тем, чтобы в полевых условиях на рыбоводном пункте можно было точно рассчитать применяемые дозировки.

Заготовку гипофизов следует производить централизованно сразу для нескольких заводов с определением гонадотропной активности выпускаемого препарата с помощью тест-объектов. Централизованная заготовка опытными специалистами позволяет обеспечить высокое качество гипофизов и возможность применения оптимальных доз.

 

 

Определение качества гипофизов

 

 

Для определения количества гормонов, находящихся в гипофизах, и

качества получаемых препаратов осуществляют биологическое тестирование, которое сводится к выяснению различных реакций органов животных, получивших инъекцию исследуемых препаратов. Обычно для биологического тестирования используют вьюна и лягушек.

Вьюн после введения гипофиза всегда дает количественно определяемую четкую реакцию. Определение единицы активности гипофиза рыб производят с помощью установленного Б.Н. Казанским понятия вьюновой единицы (в.е.).

Вьюновая единица — это такое количество гонадотропного гормона, которое необходимо, чтобы вызвать через 50—80 ч после инъекции созревание икры и овуляцию у зимних самок вьюна IV стадии зрелости массой 35—45 г при температуре воды 16— 18° С в лабораторных условиях.

В целях выяснения активности исследуемого препарата гипофиза во вьюновых единицах нескольким группам самок одновременно производят гипофизарные инъекции с различными дозами гипофиза.

Наименьшая доза, вызвавшая созревание, и соответствует вьюновой единице. Зная ее, можно сравнивать содержание гонадотропного гормона в

 


различных гипофизах.

Использование вьюнов в качестве тест-объектов затрудняется в связи с ограниченностью их распространения в естественных водоемах.

Более доступным объектом являются лягушки. Их легко можно получать в необходимых количествах в любое время года. Положительной реакцией у лягушек служит появление подвижных сперматозоидов в клоаке после введения суспензии гипофиза в спинные лимфатические мешки. Эта реакция наступает очень быстро — через 40—50 мин. В этом состоит второе преимущество работы с лягушками по сравнению с вьюнами.

Лягушек-самцов заготавливают поздней осенью в местах их концентрации для зимовки. Содержат их в воде при температуре 1,5°С, слабой проточности и небольшой освещенности.

Тестирование препарата следует осуществлять ежегодно в одни и те же сроки. Так, в дельте Волги это делают в первой половине марта.

Лягушек выводят из зимнего состояния, медленно повышая температуру воды и доводя ее через неделю до 16—18°С. Тестирование дает лучшие результаты при температуре 18—23°С.

Проверку производят следующим образом. Вначале отбирают партии по 8—10 гипофизов, отличающихся цветом и величиной. Затем их взвешивают на аналитических весах с точностью до 0,1 мг. Взвешенный препарат растирают в ступке, постепенно увлажняя до получения однородной сметаноподобной консистенции. Затем в препарат добавляют физиологический раствор, и суспензия готова для инъецирования.

Инъекцию производят одновременно 5 лягушкам. Всего испытывают 3 группы лягушек. Каждую группу инъецируют определенной дозой: 0,2; 0,3 и 0,4 мг сухого препарата гипофиза.

Показателем биологической активности испытуемого препарата гипофиза является минимальная весовая доза, вызывающая реакцию спермации более чем у половины проинъецированных лягушек. Биологическую активность препарата рассчитывают путем деления единицы на весовой показатель минимальной эффективной дозы.

Одна лягушечья единица (л.е.) — это активность минимальной весовой дозы препарата, вызывающая спермации у самца лягушки.

Ацетонированный препарат гипофиза должен иметь стандартную,

заранее известную активность, которая равна 3,3 лягушачьих единицы.

Использование препарата позволит расходовать заготовленные гипофизы более экономно. Кроме того, в тех случаях, когда после проведения гипофизарной инъекции созревание производителей не наблюдается, облегчается анализ причин этого явления. Следует также иметь в виду, что дозу вводимого препарата на единицу массы производителей нужно рассчитывать с учетом биологической активности каждой данной партии гипофизов.

Кроме вышеизложенной методики определения активности

ацетонированных гипофизов существует несколько других методов такой проверки. В частности, Б.Ф. Гончаров предложил для определения качества гипофизов использовать систему созревания икринок вне организма.


Проверка осуществляется следующим образом. Щупом берется проба

икры и помещается в физиологический раствор с 0,1°/0-ным раствором

кристаллического альбумина. Туда же добавляется суспензия гипофиза. Если

самка подготовлена к созреванию, то зародышевый пузырек растворяется.

Преимущества предлагаемого метода состоят в том, что он является чувствительным, дает возможность получать большой цифровой материал и его можно использовать непосредственно на рыбоводных заводах в сезон проведения работ с производителями.

При этом методе доза вводимого гипофиза рассчитывается в миллиграммах ацетонированного гипофиза на 1 кг массы производителя или в миллиграммах на одного самца или одну самку.

Правильная дозировка во многом предопределяет качество получаемых половых продуктов. Если доза окажется недостаточной, созревание производителей не произойдет. При увеличенной дозе гормонального препарата снижается качество икры или спермы.

При более низких температурах (в пределах диапазона нерестовых температур) для созревания производителей необходимы более высокие дозы препарата, при температурах, близких к верхней границе нерестовых температур, количество гормонального препарата снижается. Для созревания самцов по сравнению с самками нужно вводить меньше гормонального препарата.

Осетровые рыбоводные заводы получают ацетонированные гипофизы с заранее определенной гонадотропной активностью. Однако она не всегда остается постоянной.

При хранении гипофизов более года их гонадотропная активность снижается. Процесс ухудшения качества гипофизов замедляется при их хранении в герметически закрытой посуде в сухом помещении при низкой температуре.

 

 

Гипофизарная инъекция

 

 

Высушенный гипофиз в чистой стеклянной или фарфоровой ступке

растирают пестиком в порошок, затем взвешивают необходимую дозу на аналитических или торзионных весах для каждой партии инъецируемых производителей раздельно для самок и самцов.

Взвешенную дозу вносят в физиологический раствор (6,5 г химически чистой поваренной соли, растворенной в 1 л дистиллированной воды) и еще немного растирают. Затем к этой массе добавляют еще одну порцию


физиологического раствора в3 таком количестве, чтобы на одного

производителя приходилось 2 см суспензии. Затем ее несколько раз тщательно

взбалтывают с помощью шприца и переносят в склянку с широким горлышком и притертой пробкой.

Перед началом инъецирования содержимое склянки еще несколько раз тщательно перемешивают. Суспензию шприцем вводят в мышцы спины. После

 


инъекции иглу осторожно вынимают. Место прокола кожи прижимают

пальцем, а затем немного массируют. Это нужно делать во избежание вытекания введенного препарата.

Необходимое количество ацетонированного порошка гипофиза, взятого от осетровых, которое следует впрыскивать одной особи при нерестовой

температуре, определяется согласно данным, приведенным ниже (Таблица 5).

Таблица 5

Необходимое количество гипофиза для инъекции

Дозировка порошка

Температура воды


Вид рыбы


Гипофиза, мг


 

Белуга

 

Осетр

 

Севрюга


при инъекции, °С

9—11

12—13 14—15 9—10

11—13 14—16 17—20 17—18 18—21 22—24


Самкам

250 200 150 60 50 40 30 40 30 25


Самцам

150 100 100 50 40 30 30 30 25 15


 

При температуре воды ниже нерестовой на 2—3°С дозу гипофиза

увеличивают на 30—50 %.

Гипофизарные инъекции дают положительные результаты лишь при завершении у производителей IV стадии зрелости половых продуктов. Показателем такого состояния яйцеклеток служит смещение имеющихся у них

ядер к каналу (микропиле), через который сперматозоид проникает в икринку.

Четвертая стадия у самцов характеризуется завершенностью процесса образования спермиев. У таких самцов преобладают зрелые, вполне сформированные сперматозоиды.

Хорошие результаты дают однократные инъекции ацетонированного препарата. Вместе с тем иногда они оказываются недостаточно результативными. Такое положение наблюдается, когда общее состояние производителей ухудшено или развитие икры полностью не завершено. При такой ситуации иногда целесообразно производить повторные инъекции небольших доз препарата.

Однако всегда надо помнить, что увеличенные, по сравнению с научно обоснованными, дозы препарата гипофиза приводят к снижению качества получаемых зрелых половых клеток. Объясняется это тем, что в порошке ацетонированного гипофиза содержатся и такие гормоны, которые не нужны непосредственно для созревания половых клеток. В результате создаются побочные эффекты, организм приходит в состояние большого напряжения (стресса).

 


Успешное проведение гипофизарных инъекций во многом зависит от

того, как содержатся производители. На всех этапах этой операции — перед, во время и после введения в тело рыбы препарата гипофиза — с самками и

самцами следует обращаться очень бережно, не допускать их травмирования.

В водоемах, предназначенных для производителей, должен быть хороший кислородный режим, самок и самцов следует содержать раздельно. Перед инъецированием их переводят в небольшие бетонированные бассейны или садки, в которых создают оптимальные условия для того, чтобы гарантировать созревание половых продуктов после введения в тело гормонального препарата.

 

Контрольные вопросы:

 

 

6. Как устроен гипофиз?

7. Когда и как заготавливают гипофизы? 8. Как определяют качество гипофизов?

9. Как осуществляется гипофизарная инъекция?

10.Как заготавливают производителей?

11.В какой последовательности работают с производителями при

получении половых продуктов?

 

Подтема 1.3: Определение времени созревания

Производителей

 

 

После введения гипофиза у рыб начинается период созревания (до

получения зрелой икры), длительность которого зависит от температуры воды и исходного состояния самок.

А.С. Гинзбург и Т.А. Детлаф установили, что при одинаковой средней температуре период созревания всегда намного короче периода зародышевого развития (в 4—6 раз). Отсюда следует, что при повышении или понижении температуры соответственно изменяется продолжительность периодов созревания и зародышевого развития.

Выявление такой закономерности позволило А.С. Гинзбург и Т.А. Детлаф построить графики вероятных сроков созревания самок осетровых при различной температуре в зависимости от продолжительности их зародышевого развития (Рис. 22).

 


Рис. 22 Графики зависимости продолжительности созревания осетров от температуры.

Кривые показывают время: 1 — созревания первых самок, 2 — созревания больше половины

самок, 3— через которое самок, не обнаруживающих признаков созревания, можно сдавать

промысловикам. Заштрихованная полоса показывает период, в течение которого при

нормальных условиях созревают до 80% инъецированных самок.

 

 

На графиках нанесены кривые, указывающие время, когда после

гипофизарных инъекций можно ожидать созревание самок. По графикам также можно определить сроки просмотра самок и взятия проб, высчитав сначала среднюю температуру за период созревания.

Расчет производится так. В 19 ч накануне дня получения икры и в 7 ч утра в день взятия икры высчитывается средняя температура, начиная со времени инъекции производителей.

Затем на горизонтальной оси находят точку, соответствующую средней температуре за период созревания, и восстанавливают из нее перпендикуляр до пересечения с кривыми. Точка пересечения с кривой показывает, через сколько часов созревают первые самки.

Полученное число часов добавляют ко времени инъекции и выявляют время начала просмотра самок. Точка пересечения с кривой дает возможность таким же образом определить сроки созревания многих самок. Границы

заштрихованной зоны показывают время созревания большинства самок.

Время, после которого свежевыловленных или кратковременно резервированных самок, не обнаруживших признаков созревания, необходимо изымать из садков и сдавать на приемный пункт, показано на кривой 2. По пунктирной кривой можно определить удлинение периода созревания, что


возможно при повышении температуры.

Пользуясь этим графиком, можно определить сроки инъекции суспензии гипофизов самкам осетровых, чтобы получать икру в удобное для работы время. В результате облегчается работа с производителями, сокращается число необходимых просмотров самок, повышается качество икры, а также

сокращаются потери в результате ее перезревания или недозревания.

При расчете требуемого показателя вначале определяют среднюю температуру за сутки до инъекции. Затем на горизонтальной оси графика созревания самок находят точку, соответствующую этой температуре, и восстанавливают из нее перпендикуляр до пересечения с кривой 1.

Из точки пересечения опускают перпендикуляр на вертикальную ось и определяют по ней число часов, которое пройдет при данной средней температуре от инъекции до созревания первых самок. Высчитанное таким образом число часов отнимают от времени начала рабочего дня и получают то время, когда надо инъецировать самок.

Метод определения степени зрелости половых желез самок без вскрытия рыбы предложил также В.З. Трусов. Этот метод сводится к тому, что у самок с помощью щупа из яичника извлекают несколько икринок. Пинцетом их переносят в пробирку с формалином. Пробирки вносят в помещение, где установлен замораживающий микротом.

Икринки размещают на столике так, чтобы срезы микротомной бритвы проходили через их анимальный и вегетативный полюса. Затем икринки заливают из глазной пипетки водой, после чего покрывают столик металлическим колпаком и замораживают срезы, добавляя из баллона углекислый газ.

Срезы делают до тех пор, пока не появится хорошо видимое невооруженным глазом или под лупой ядро. Если оно лежит вплотную к оболочкам, то состояние половой железы самки находится в IV завершенной стадии зрелости.

Метод определения степени зрелости половых желез самок, предложенный В.З. Трусовым, сравнительно прост, надежен и занимает мало времени: анализ одной пробы можно осуществить за 5—8 мин.

Созревание самок контролируется также путем непосредственного наблюдения. Контроль усиливается в течение последних шести часов — наиболее вероятного при данной температуре срока созревания.

Еще более простой экспресс-метод определения зрелости гонад у производителей осетровых разработали проф. Б.Н. Казанский, Ю.А. Феклов, С.Б. Подушка и А.Н. Молодцов.

Сущность метода состоит в том, что с помощью щупа из задней части яичника берут пробу икры, щуп вводится в полость тела под углом 30°, что позволяет не задевать жизненно важные органы. Щуп имеет наконечник, заполняемый икрой, и стержень, обеспечивающий его опорожнение.

Общая длина щупа—125 мм, наконечника — 65 мм, в том числе заостренной части — 20 мм. Наружный диаметр стержня — 4,5 мм. Щуп заканчивается ручкой, расположенной перпендикулярно стержню.


Извлеченные щупом икринки для выяснения степени завершенности IV

стадии зрелости в течение 2 мин кипятят. Отвердевшие икринки разрезают лезвием безопасной бритвы по оси от анимального полюса к вегетативному. Срезы рассматривают под лупой или бинокуляром.

Степень поляризации яйцеклетки определяют положением ядра относительно анимального полюса. Показатель поляризации определяют по

формуле, предложенной Ю. А. Фекловым:

 

l=А/В

где:

l —показатель поляризации;

А — расстояние от ядра до оболочки;

В — наибольшее расстояние по оси от анимального до вегетативного полюса.

 

Чем меньше значение l, тем больше поляризована яйцеклетка и тем

больше завершенность IV стадии зрелости гонад. Наибольшая поляризация ооцита наблюдается при l = 1/30÷1/40.

Если брюшко самки при прощупывании оказывается более мягким, чем было до инъекции, то это свидетельствует о возможном созревании икры у данной особи.

Чтобы в этом удостовериться, под самку следует подвести рыбоводные носилки с водой, приподнять их и установить на козлы. В это время рыба делает резкие движения, и если икра созрела, то на носилках можно заметить выделившиеся икринки.

После того как самка успокоится, ее поворачивают на бок и ощупывают брюхо. У созревшей особи при массировании задней трети брюха струей свободно вытекает икра.

Таким образом, как отмечают А.С. Гинзбург и Т.А. Детлаф, показателями к вскрытию самок служат мягкое брюшко, выбивающаяся сильной струей икра, западание брюшной стенки при подъеме самки.

От полностью созревшей самки необходимо сразу же получить икру.

 

 







©2015 arhivinfo.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.