Главная | Обратная связь

Определение триглицеридов в сыворотке крови с ацетилацетоном.

Принцип метода:

Триглицериды омыляются едким кали с образованием глицерина, при окислении которого образуется формальдегид.

Реактив, содержащий ацетилацетон, взаимодействует с формальдегидом с образованием 3,5-диацетил-1,4-дигидролутидина, окраску которого измеряют.

Материал для исследования:

1. Сыворотка крови;

2. Плазма (антикоагулянт – ЭДТА).

Реактивы:

1. Изопропанол;

2. Адсорбент;

3. Раствор КОН;

4. Окислительный раствор;

5. Реактив, содержащий ацетилацетон;

6. Стандартный раствор триглицеридов.

Ход определения:

№	Реактивы	Раствор сравнения	Эталон	Проба
1. 2. 3. 4.	Дистиллированная вода (мл) Эталонный раствор (мл) Сыворотка крови (мл) Изопропанол (мл)	0,1 - - 4,0	- 0,1 - 4,0	- - 0,1 4,0
Перемешивают и добавляют с помощью мерной ложечки
5.	Адсорбент (г)	0,4	0,4	0,4
Встряхивают (10-15 мин), центрифугируют 5 мин. при 3000 об/мин.
6. 7.	Супернатант (мл) Раствор КОН (мл)	2,0 0,5	2,0 0,5	2,0 0,5
Содержимое пробирок перемешивают, пробирки закрывают пробками, инкубируют 5-10 мин. при температуре 60º±2ºС. После этого охлаждают в холодной воде и добавляют
8.	Окислительный раствор (мл)	0,5	0,5	0,5
Содержимое пробирок после добавления окислительного раствора немедленно перемешивают и оставляют стоять при комнатной температуре 10 мин. Добавляют:
9.	Реактив (мл)

Содержимое пробирок перемешивают, неплотно закрывают пробками и раствор инкубируют точно 30 мин. при температуре 60º±2ºС. После охлаждения измеряют оптическую плотность пробы и эталона против раствора сравнения в кювете 0,5 см при длине волны 410 нм.

Расчет результатов:

По оптической плотности пробы D_о и эталона D_ст рассчитывают содержание ТГ (х) в ммоль/л пробы по формуле:

	Dо
С =	--------------	* Сст
	Dст

 

 

С_ст = 3,39 ммоль/л

Коэффициенты пересчета мг/дл * 0,113 = моль/л

ммоль/л * 88,55 = мг/дл

Примечания:

Экстракцию проводят в центрифужных пробирках, закрытых полиэтиленовыми или стеклянными пробками.

Адсорбент дозируют с помощью мерной ложечки, входящей в набор (около 0,4 г).

Омыление и прочие реакции проводят в тонкостенных пробирках объемом 15 мл, неплотно закрытых пробками.

Проведение испытания можно приостановить до следующего дня в стадии омыления КОН (после охлаждения пробирки необходимо хорошо закрыть, чтобы раствор не испарялся), но проведение испытания во времени при окислительной и цветной реакциях необходимо строго соблюдать.

Если проба хранится при температуре -20ºС, содержание ТГ в плазме остается неизменным в течение 8 недель.

При длительном хранении при комнатной температуре липаза сыворотки разлагает ТГ на свободные жирные кислоты.

До приобретения определенного опыта рекомендуется проводить дублированный анамнез. В одной серии должно обрабатываться не более 20 проб.

Применяемая посуда должна быть очищена от жирных загрязнений и синтетических моющих средств.

Если полученные величины превышают 4,5 ммоль/л, сыворотку разводят водой в соотношении 1:1 (а результат умножают на 2).

Отбор пробы для определения ТГ должен проводиться после не менее чем 14-часового воздержания от пищи. Слабый гемолиз не влияет на определение.