 |
|
Лабораторные работы
Лабораторная работа 1.Подсчет эритроцитов.
В норме количество эритроцитов составляет около 3,9-4,7 млн./мм3 у женщин и 4,0-5,5 млн./мм3 у мужчин.
Для подсчета форменных элементов кровь, взятую из пальца, разбавляют в специальных смесителях (меланжерах), чтобы создать нужную концентрацию клеток, удобную для подсчета (рисунок 1). Затем заполняют разбавленной кровью счетную камеру (рисунок 2) и подсчитывают под микроскопом число форменных элементов.
Цель работы: овладеть техникой подсчета эритроцитов.
Оборудование: микроскоп; счетная камера Горяева; меланжеры для красных кровяных телец; чашечка для разбавляющей жидкости; вата; 0,9 %-ный раствор хлорида натрия; спирт; эфир.
Ход работы.
1. Рассмотрите счетную камеру под микроскопом при малом и большом увеличении.
Подсчет эритроцитов производится при помощи счетных камер. В клинике чаще всего применяется счетная камера Горяева, которая представляет собой толстое прямоугольное стекло с двумя сетками, выгравированными на его поверхности. Сетки отделены друг от друга поперечной канавкой, которая предотвращает затекание жидкости. Двумя глубокими продольными канавками сетки отделены от стеклянных прямоугольных пластинок, к которым притирают шлифованное покровное стекло. Плоскость поверхности этих пластинок находится на 0,1 мм выше плоскости, в которой нанесены сетки.
Сетка камеры Горяева состоит из 225 больших квадратов со стороной 1/5 мм, площадью 1/25 мм2 и объемом 1/250 мкл. Сто квадратов не разлинованы; 25 больших квадратов разделены каждый на 16 малых со стороной 1/20 мм, площадью 1/400 мм2 и объемом 1/4000 мкл.
Кровь для подсчета эритроцитов разводится 0,9%-ным раствором хлорида натрия в специальном смесителе в 100 или 200 раз. Смеситель представляет собой капиллярную пипетку с ампулообразным расширением, на которой нанесены метки 0,5; 1; 101. Метки 0,5 и 1 показывают, какую часть составляет данный столбик капилляра по отношению ко всему объему смесителя. Если набрать кровь до метки 0,5, а раствор до метки 101, то кровь будет разведена в 200 раз; если набрать кровь до метки 1, а раствор до метки 101, то кровь будет разведена в 100 раз.
2. Подготовьте к работе камеру Горяева. Для этого ее промывают дистиллированной водой и насухо вытирают. На участок камеры, где нанесены сетка, нужно уложить обезжиренное покровное стекло. Нижняя поверхность камеры находится на третьих пальцах обеих рук, двумя вторыми пальцами придерживают камеру спереди. Двумя пальцами притирают покровное стекло, плавно продвигая его по поверхности прямоугольных пластинок до появления в местах соприкосновения покровного стекла с поверхностью пластинок цветных колец Ньютона.
3. Подготовьте кровь для подсчета эритроцитов. Для этого наливают в чашечку для разбавляющей жидкости 0,9%-ный раствор хлорида натрия. Иглой делают укол в предварительно обработанную спиртом и эфиром мякоть четвертого пальца левой руки. В выступившую каплю крови погружают кончик смесителя, набирают кровь до метки 0,5 или метки 1 и разводят ее в 100 или 200 раз 0,9%-ным раствором хлорида натрия, набирая его до метки 101.
Поместив смеситель между первым и третьим пальцами, тщательно перемешивают его содержимое. Затем, выпустив из смесителя две-три капли жидкости на вату, следующую каплю помещают перед щелью, образованной покровным стеклом и пластинкой камеры Горяева с нанесенной сеткой. Под действием капиллярных сил жидкость заполняет камеру. До начала подсчета эритроцитов нужно оставить камеру на 1-2 мин. для осаждения форменных элементов.
4. Рассмотрите сетку под микроскопом при малом увеличении, а затем при большом увеличении. Подсчитайте эритроциты при большом увеличении в малых квадратах сетки. Для получения удовлетворительных результатов подсчитывают эритроциты в 80 малых квадратах, что соответствует 5 большим квадратам счетной сетки.
Подсчитывают все эритроциты, лежащие внутри малого квадрата, и те, которые находятся на его верхней и левой границах.
Количество эритроцитов (Э) в 1 л крови подсчитывают по формуле:
Э = N х 4000 х 200 х 106 ,
где N – количество эритроцитов в пяти больших квадратах; 4000 – множитель, приводящий объем малого квадрата (1/4000 мкл) к объему 1 мкл крови; 200 – поправка на степень разведения крови; 80 – количество малых квадратов, в которых был произведен подсчет; 106 – количество микролитров в 1 л.
Рекомендации по оформлению работы. Запишите полученные результаты подсчета эритроцитов. Сравните количество эритроцитов с нормой, сделайте выводы.
Лабораторная работа 2.Подсчет лейкоцитов.
В норме количество лейкоцитов составляет около 4,0-9,0 тыс./мм3.
Цель работы: овладеть техникой подсчета лейкоцитов.
Оборудование: микроскоп; счетная камера Горяева; меланжеры для белых кровяных телец; скарификатор; чашечка для разбавляющей жидкости; вата; 3%-ный раствор уксусной кислоты, подкрашенный метиленовым синим; спирт; эфир.
Ход работы.
Подсчет лейкоцитов производится с помощью камеры Горяева. Предварительно кровь разводится в специальном смесителе 3%-ным раствором уксусной кислоты, подкрашенной метиленовой синью. Смеситель представляет собой капиллярную пипетку, на которой нанесены метки 0,5; 1; 11. Смеситель дает возможность развести кровь в 10 и 20 раз.
В чашечку для разбавляющей жидкости наливают 3%-ный раствор уксусной кислоты, подкрашенной метиленовой синью. Скарификатором прокалывают предварительно обработанную спиртом и эфиром мякоть четвертого пальца левой руки. В выступившую каплю крови погружают кончик смесителя, насасывают кровь до метки 0,5 или метки 1. Затем в смеситель набирают раствор до метки 11.
Закрыв пальцами оба конца смесителя, тщательно перемешивают содержимое.
Выпустив две – три капли смеси на вату, следующую каплю помещают перед щелью, образованной покровным стеклом и пластинкой камеры Горяева с нанесенной сеткой. До начала подсчета лейкоцитов нужно оставить камеру на 1-2 мин. для их осаждения.
Считают лейкоциты под микроскопом при малом увеличении в 100 больших квадратах. Это все большие не разлинованные квадраты, которые в сетке камеры Горяева сгруппированы по четыре.
Количество лейкоцитов в 1 л крови вычисляют по формуле:
Л = N х 4000 х 20 х 106
где N – количество лейкоцитов в 100 больших квадратах; 4000 – множитель, приводящий объем малого квадрата (1/4000 мкл) к объему 1 мкл крови; 20 – поправка на степень разведения крови; 1600 – количество лейкоцитов в малых квадратах (100 х 16 = 1600); 106 – количество микролитров в 1 л.
Рекомендации по оформлению работы. Запишите полученные результаты подсчета лейкоцитов. Сравните количество лейкоцитов с нормой, сделайте выводы.
| Рисунок 1. Меланжеры для форменных элементов крови: а) для эритроцитов; б) для лейкоцитов | Рисунок 2. Камера Горяева: а) вид сверху; б) вид сбоку; в) сетка камеры |
Лабораторная работа 3.Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) по Т. П. Панченкову.
Кровь при движении – устойчивая суспензия. При отстаивании кровь разделяется на верхний светлый слой плазмы и нижний красный слой форменных элементов, среди которых преобладают эритроциты.
СОЭ заключается в склеивании эритроцитов и оседании их на сосуде, в котором находится кровь. Эритроциты заряжены отрицательно, и поэтому они, отталкиваясь друг от друга, не склеиваются. Однако при адсорбции различного вида частиц, например, белка, эритроциты теряют свой заряд, что делает возможным их склеивание с другими эритроцитами. Образовавшиеся комочки эритроцитов начинают оседать на дне сосуда, куда была помещена кровь. У здорового человека адсорбция незначительна и, соответственно, скорость оседания эритроцитов очень мала.
СОЭ (РОЭ) зависит от состояния организма. При некоторых физиологических состояниях, например, беременности, и при целом ряде заболеваний (туберкулез, ревматизм и др.) оседание эритроцитов бывает значительно ускоренным.
В норме СОЭ (РОЭ) у мужчин 1-10 мм/ч, у женщин 2-15 мм/ч. Показания от 10 до 15 мм/ч расцениваются как незначительное ускорение, 15-30 мм/ч – среднее ускорение, 30 мм/ч – резкое ускорение.
Цель работы: освоить методику определения скорости оседания эритроцитов.
Оборудование: прибор Панченкова; часовое стекло; скарификатор; вата; фильтровальная бумага; 5%-ный раствор лимоннокислого натрия (цитрат); спирт; эфир.
Ход работы.
Для определения СОЭ применяют прибор Панченкова (рисунок 3), состоящий из деревянного штатива, в котором могут быть зажаты в вертикальном положении специальные капилляры. Капилляры градуированы в миллиметрах. Метка 0 стоит на расстоянии 100 мм от конца. На капилляре есть еще две метки: К (кровь) - на высоте нуля и метка Р (реактив) – на уровне 50 мм.
1. Капилляр аппарата Панченкова хорошо промывают 5%-ным раствором лимоннокислого натрия, набирают этот раствор до метки Р и выдувают на стекло.
2. В тот же капилляр до метки К набирают кровь (без натягивания ее ртом) и выдувают ее на то же часовое стекло.
3. Смесь перемешивают, несколько раз набирая и выдувая. Затем смесь набирают точно до метки К. Для набирания смеси держат капилляр почти горизонтально, а кончик его приставляют к смеси, находящейся на часовом стекле.
4. Капилляр переводят в вертикальное положение, предварительно зажав верхнее отверстие большим пальцем, и помещают в одно из гнезд аппарата Панченкова. Замечают время.
5. Вследствие постепенного оседания эритроцитов верхний слой раствора, находящийся в капилляре, становится светлым. По высоте неокрашенного столбика определяют, на сколько мм осели эритроциты за один час.
Рекомендации по оформлению работы. Запишите полученные результаты. Сравните результаты определения СОЭ нескольких испытуемых и дайте им оценку.
Лабораторная работа 4.Определение содержания гемоглобина в крови колориметрическим методом А. Сали.
Гемоглобин является главной составной частью эритроцитов. Это сложный белок, хромопротеид.
Функция гемоглобина – перенос O2 от легких к тканям и отчасти CO2 в обратном направлении. Определение содержания гемоглобина обязательно проводится в ходе анализа крови.
Определение гемоглобина в крови производится колориметрическим методом при помощи гемометра Сали (рисунок 4). Метод основан на сравнении интенсивности окраски исследуемого раствора с интенсивностью окраски стандартного раствора. Гемоглобин крови превращается под действием соляной кислоты в солянокислый гематин, окрашивающий раствор в коричневый цвет. Полученный раствор колориметрируется.
|
Рисунок 3. Прибор Панченкова: а) штатив с капиллярами; б) капилляр; 0; 50; 100; К и Р – метки на шкале капилляра
Гемометр Сали представляет собой штатив, задняя стенка которого выполнена из матового стекла. В штативе находятся три пробирки одинакового диаметра. Две крайние пробирки запаяны и содержат раствор солянокислого гематина. Средняя пробирка открыта и градуирована. В набор входят также капилляр, пипетка с меткой 20 мм3 и стеклянная палочка.
Содержание гемоглобина в крови выражается в г/л и (или) в г%. В среднем содержание гемоглобина 14 г%, у женщин – 12,1-13,8 г% или 121-138 г/л; у мужчин – 13,3 -15,6 г% или 133-156 г/л.
Цель работы: ознакомиться с методикой определения количества гемоглобина в крови по методу А. Сали.
Оборудование: гемометр Сали; скарификатор; вата; фильтровальная бумага; 0,1 N раствор НСl; спирт; эфир; раствор йода; дистиллированная вода.
Ход работы.
1. В градуированную пробирку наливают раствор децинормальной соляной кислоты до нижней контрольной круговой отметки. Затем в пробирку с помощью капилляра вносят 20 мм3 исследуемой крови, полученной уколом иглы в мякоть пальца.
2. Смесь крови с соляной кислотой тщательно перемешивают посредством легких ударов по нижнему концу пробирки. Красный цвет гемолизированной крови в результате образования солянокислого гематина переходит в коричневый.
3. Наблюдают за изменением цвета крови в течение 5 минут. По истечении этого времени жидкость осторожно разбавляют дистиллированной водой до тех пор, пока интенсивность ее окраски не совпадет с интенсивностью окраски стандартного раствора. Цифра, стоящая на уровне полученного раствора, показывает количество гемоглобина в граммах на 100 мл крови, т.е. концентрацию гемоглобина в грамм-процентах (г%). Конечный результат выражается в г/л, для чего полученную величину умножают на 10.
Рекомендации по оформлению работы. Запишите полученные данные содержания гемоглобина в крови и сравните их с нормой.
|
Рисунок 4. Гемометр Сали (ГС-3):
1 – запаянные пробирки со стандартной жидкостью; 2 – градуированная пробирка; 3 – капилляр вместимостью 0,02 мл
Лабораторная работа 5.Определение осмотической резистентности эритроцитов.
Резистентностью эритроцитов называется их устойчивость по отношению к гипотоническим растворам. В гипотонических растворах эритроциты разрушаются, и гемоглобин выходит в раствор. Это явление называется гемолизом. Кровь при этом становится как бы блестящей, приобретает характерный ярко-красный цвет и называется лаковой. Резистентность отдельных эритроцитов различна.
Минимальная резистентность определяется концентрацией хлорида натрия, при которой начинается гемолиз, т.е. разрушаются наименее устойчивые эритроциты. Концентрация поваренной соли, при которой будут разрушены все эритроциты (раствор прозрачный, лаковый), определит максимальную резистентность: даже максимально устойчивые эритроциты подверглись гемолизу.
У здорового человека в норме резистентность эритроцитов составляет 0,46-0,48 %. Максимальная резистентность эритроцитов составляет от 0,24 до 0,30, а минимальная - от 0,48 до 0,52 (числа обозначают % хлорида натрия в растворе).
Цель работы: ознакомление с методикой исследования осмотической резистентности эритроцитов.
Оборудование:мерные пипетки; штативы для пробирок; пробирки; 1%-ный раствор хлорида натрия; дистиллированная вода; дефибринированная кровь.
Ход работы.
1. Для определения резистентности эритроцитов готовят пять пробирок с раствором хлорида натрия убывающей концентрации (таблица 1) и нумеруют их.
2. В каждую из пробирок прибавляют по 0,5 мл дефибринированной крови. Содержимое всех пробирок тщательно перемешивают и помещают на 40-50 минут в штатив. По истечении этого времени отмечают, какие изменения произошли в каждой пробирке.
3. О частичном гемолизе судят по легкому окрашиванию жидкости с гемоглобином после отстаивания эритроцитов: при встряхивании пробирки раствор оказывается мутным. При полном гемолизе раствор прозрачен, имеет характерный лаковый блеск.
Рекомендации по оформлению работы. Сравните содержимое пробирок. Отметьте, в какой пробирке наблюдается частичный, и в какой полный гемолиз. Сделайте вывод, при какой концентрации хлорида натрия произошел частичный и полный гемолиз.
Таблица 1
Приготовление растворов хлорида натрия разной концентрации
| № пробирки | Количество воды (мл) | Количество 1%-ного раствора хлорида натрия (мл) | Концентрация хлорида натрия (%) |
| 0,9 | |||
| 0,7 | |||
| 0,5 | |||
| 0,3 | |||
| 0,1 |
Лабораторная работа 6.Исследование различных видов гемолиза.
Гемолизом называют разрушение эритроцитов с выходом гемоглобина в плазму крови. Гемолизированная кровь прозрачна и называется «лаковой». Под микроскопом в ней не видно эритроцитов, так как они разрушены.
Цель работы: показать, что гемолиз может быть вызван различными факторами, имеющими неодинаковый механизм действия.
Оборудование: штатив с пятью пробирками; пипетки; физиологический раствор; дистиллированная вода; 0,1 %-ный раствор соляной кислоты; 5%-ный раствор аммиака; 5 мл цитратной крови любого животного (в пробирке).
Ход работы.
1. В штатив ставят 4 пробирки, в каждую из которых наливают по 3 мл соответственно физиологического раствора, дистиллированной воды, 0,1 %-ного раствора соляной кислоты, 5%-ного раствора аммиака; в 5-й пробирке – цитратная кровь.
2. Во все 4 пробирки вносят пипеткой по 2 капли из 5-й пробирки.
3. Оставшуюся в 5-й пробирке кровь помещают на 1 час в морозильную камеру холодильника. Затем пробирку вынимают и оттаивают в стакане с горячей водой.
4. Рассматривают содержимое всех 5–ти пробирок, сравнивают результаты.
Рекомендации по оформлению работы. Определите наличие или отсутствие гемолиза в 1, 2, 3, 4 и 5-й пробирках. Опишите механизм гемолиза в каждой пробирке.