 |
|
Лабораторные работы
Лабораторная работа 1.Определение группы крови в системе АВ0 при помощи цоликлонов.
Цоликлоны анти-А и анти-В применяют для определения группы крови системы АВ0 человека вместо стандартных гемагглютинирующих сывороток. Такой метод определения группы крови позволяет выявить наличие антигенов (агглютиногенов) А и В.
Цоликлоны анти-А и анти-В продуцируются гибридомными клеточными линиями, полученными в результате слияния мышиных антителобразующих В-лимфоцитов с клетками мышиной миеломы. Цоликлоны не вызывают неспецифической полиагглютинации эритроцитов, так как не содержат антител иной специфичности.
Скорость протекания и выраженность реакции агглютинации при использовании цоликлонов выше, чем при использовании гемагглютинирующих АВ0-сывороток.
Цель работы: освоить методику определения групп крови при помощи цоликлонов.
Оборудование: цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ; скарификатор; белая кафельная плитка; вата; спирт; эфир; йод.
Ход работы.
Определение производится в нативной крови; крови, взятой в консервант; в крови, взятой без консерванта, в том числе взятой из пальца. Используется метод прямой гемагглютинации на плоскости, на пластине или на планшете. Определение группы крови производится в помещении с хорошим освещением при температуре 15-25° С.
1. Наносят на планшет или пластину индивидуальными пипетками цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ по одной большой капле (0,1 мл) под соответствующими надписями.
2. Рядом с каплями антител наносят по одной маленькой капле исследуемой крови (0,01 – 0,03 мл).
3. Смешивают кровь с реагентами (на планшете – тщательно вымытым сухим шариком, покачивая планшет, на пластине – чистой сухой индивидуальной палочкой).
4. Наблюдают за ходом реакции с цоликлонами визуально при легком покачивании пластины или планшета в течение 3 минут. Агглютинация эритроцитов с цоликлоном обычно наступает в первые 3-5 секунд, но наблюдение следует вести 3 минуты ввиду более позднего появления агглютинации с эритроцитами, содержащими слабые разновидности А и В.
5. Результат реакции в каждой капле может быть положительным или отрицательным. Положительный результат выражается в агглютинации (склеивании) эритроцитов. Агглютинаты видны невооруженным взглядом в виде мелких красных агрегатов, быстро склеивающихся в крупные хлопья. При отрицательной реакции капля остается равномерно окрашенной в красный цвет, агглютинаты в ней не обнаруживаются.
6. Интерпретация результатов реакции агглютинации исследуемой крови с цоликлонами представлена в таблице 1.
Рекомендации по оформлению работы. Запишите, к какой группе крови принадлежит кровь.
Таблица 1
Интерпретация результатов определения группы крови системы АВ0 с использованием цоликлонов
| Результат реакции с цоликлоном | Исследуемая кровь принадлежит к группе | ||
| анти-А | анти-В | анти-АВ | |
| - | - | - | 0 (I) |
| + | - | + | А (II) |
| - | + | + | В (III) |
| + | + | + | АВ (IV) |
Лабораторная работа 4.3.2.Определение резус-принадлежности с помощью цоликлона анти-D.
Rh-агглютиноген – один из наиболее широко распространенных агглютиногенов эритроцитов. Его содержание не зависит от наличия других агглютиногенов эритроцитов. Rh-агглютиноген (Rh-фактор) крови не имеет в плазме врожденных агглютининов, однако может являться причиной несовместимости крови при повторном ее переливании.
Действующим началом цоликлона анти-D являются антитела, которые принадлежат к классу иммуноглобулинов М. Они вызывают прямую агглютинацию эритроцитов, содержащих резус-фактор.
Цоликлон анти-D может быть использован для выявления D-антигена в любых вариантах прямой реакции агглютинации: на плоскости, в пробирке, в микроплате.
Цель работы: знакомство с методикой определения резус-принадлежности крови.
Оборудование: цоликлон анти-D; скарификатор; белая кафельная плитка; вата; спирт; эфир; йод.
Ход работы.
Определение D-антигена производится в нативной крови, стабилизированной консервантом; в крови, взятой без консерванта; в крови, взятой из пальца.
1. На пластинку со смачиваемой поверхностью наносят большую каплю (0,1 мл) реагента. Рядом помещают маленькую каплю (0,01-0,05 мл) исследуемой крови и смешивают кровь с реагентом.
Наиболее крупная агглютинация наблюдается при использовании эритроцитов в высокой концентрации. Реакция агглютинации начинает развиваться через 10–15 секунд, четко выраженная агглютинация наступает через 30–60 секунд. Использование подогретой до 37-40°С пластинки сокращает время наступления агглютинации.
2. Результаты агглютинации учитывают через 3 минуты. Пластинку после смешивания реагента с кровью рекомендуется покачивать не сразу, а через 20-30 секунд, что позволяет за это время развиваться более плотной крупнолепестковой агглютинации.
Рекомендации по оформлению работы. Опишите результаты определения резус-фактора. Зарисуйте агглютинацию эритроцитов.
Лабораторная работа 4.3.3.Определение времени свертывания крови.
Жидкое состояние циркулирующей крови и ее свертывание обеспечиваются взаимодействием двух систем: противосвертывающей и свертывающей.
Процесс свертывания крови – важнейшая ферментативная многофазная реакция, с помощью которой организм борется с потерей крови при травме. Время свертывания крови составляет около 3-6 минут.
Свертывание крови – чрезвычайно сложный биохимический процесс, конечное звено которого – превращение фибриногена в фибрин. При повышении температуры свертывание крови протекает быстрее, при понижении - медленнее.
Цель работы: овладеть одной из методик определения времени свертывания крови.
Оборудование: скарификатор; предметное стекло; часовое стекло; иголка; вата; спирт; эфир; песочные часы на 0,5 мин.; водяная баня холодная (0-5˚ С) и теплая (37-40˚ С).
Ход работы.
1. Помещают несколько капель крови на обезжиренное и нагретое на ладони часовое (или предметное) стекло. Чтобы избежать охлаждения стекла, а тем самым и крови, не ставят его на стеклянную и металлическую поверхность.
2. Каждые 0,5 минут проводят через кровь чистую иглу. Отмечают время, когда на стекле появятся первые сгустки крови (фибрина). У здорового человека это составит 5-6 мин.
3. Выявляют влияние температуры на время свертывания крови. Для этого повторяют определение при более низкой и при более высокой температуре, поставив предварительно одно часовое стекло в водяную баню с холодной водой, а другое – с теплой водой.
Рекомендации по оформлению работы. Опишите результаты определения времени свертывания крови при разной температуре. Запишите схему основных этапов процесса свертывания крови.