 |
|
Лабораторная работа
Методы определения глюкозы можно разделить на 3 группы:
- Методы, основанные на восстанавливающих свойствах глюкозы (например, метод Хагедорна – Йенсена). Эти методы неспецифичны, т.к. кроме глюкозы в крови могут быть другие редуцирующие вещества (аскорбиновая кислота, фруктоза, галактоза, ряд лекарственных препаратов), которые завышают истинные значения глюкозы в среднем на 30%.
- Методы, основанные на превращении глюкозы в оксиметилфурфурол и его конденсации с ароматическими аминами (О-толуидин) с получением окрашенного продукта. Методы просты и достаточно специфичны, поэтому удобны для практики.
- Ферментативные методы. Самые специфичные и точные.
1. Определение глюкозы в крови глюкозооксидазным методом.
| Оборудование: | 1. | Штатив с пробирками. | |
| 2. | Пипетки на 1 мл и 0,2 мл. | ||
| 3. | КФК. | ||
| 4. | Кюветы на 3 мм. | ||
| 5. | Иммунологические планшеты. | ||
| 6. | Диагностические тест-полоски. | ||
| Реактивы: | 1. | Рабочий раствор (ферментативно-хромогенный раствор). | |
| 2. | Стандартный раствор глюкозы. | ||
| 3. | Дистиллированная вода. | ||
| 4. | Сыворотка крови. | ||
| 5. | Моча | ||
Принцип метода. Глюкозооксидаза окисляет глюкозу с образованием перекиси водорода, которая под действием пероксидазы окисляет хромоген хлоркрезол с образованием окрашенного продукта. Обе реакции протекают одновременно.
Ход работы. Внести в пробирки образцы сыворотки крови и реагенты по схеме:
| Реактивы (мл) | Опытная проба | Стандартная проба | Контроль |
| Рабочий раствор | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
| Сыворотка | 0,2 | ---- | ---- |
| Стандартный раствор глюкозы (10ммоль/л) | ---- | 0,2 | ---- |
| Дистиллированная вода | ---- | ---- | 0,2 |
Пробы тщательно перемешать и инкубировать 15 мин при 37ОС, затем интенсивно встряхнуть. Измерение оптической плотности проводят при длине волны 490 нм в кювете толщиной 3 мм против контроля. Расчет концентрации глюкозы проводят по формуле:
С = (ЕО/ЕС) х 10, где
С – концентрация глюкозы в ммоль/л.
ЕО – оптическая плотность опытной пробы.
ЕС – оптическая плотность стандартной пробы.
10 – концентрация глюкозы в стандартной пробе, ммоль/л.
Норма глюкозы крови утром натощак – 3,3-5,5 ммоль/л.
2. Определение глюкозы в моче.
В лунки иммунологического планшета вносят 0,05 мл мочи и 0,2 мл рабочего реактива.
Отсутствие развития окраски в течение 2 мин свидетельствует об отсутствии глюкозы в данной пробе. Пробы мочи, вызывающие покраснение реакционной смеси, считают положительными.
3. Определение глюкозы в моче с использованием тест-полосок
Тест-полоска, предназначенная для качественного экспресс-анализа содержания глюкозы в моче, представляет собой полоску полимерного материала с наклеенным аналитическим элементом в виде квадрата светло-бежевого, светло-розового или желтого цвета (в зависимости от красителя), выполненного из любого фильтрующего материала. На аналитический элемент нанесены глюкозооксидаза и пероксидаза.
Тест-полоску погружают в мочу на 1-2 секунды и вынимают, оставшуюся на полоске мочу удаляют о край сосуда и выдерживают на воздухе от 1 до 3 минут. Визуально определяют цвет. Переход светло-бежевого цвета в синий, светло-розового в красный, желтого в зеленый учитывают как положительный результат. Положительные пробы мочи направляются на количественное исследование.
Чувствительность метода составляет 1,4 – 5,6 ммоль/л или не более 0,1% массовой доли глюкозы в исследуемой моче.
Диагностическое значение определения глюкозы в крови и моче
Для диагностики целого ряда заболеваний (к числу которых прежде всего следует отнести сахарный диабет, патологические состояния, связанные с недостаточностью функции печени и почек, некоторые эндокринные заболевания, новообразования мозга, поджелудочной железы и надпочечников, гиповитаминоз В1, а также ряд наследственных аферментозов) важно иметь объективное представление о состоянии углеводного обмена, главным показателем которого служит содержание глюкозы в крови.
Гипергликемия – это увеличение содержания глюкозы в крови выше нормы (до 6,7 – 7,0 ммоль/л). Наблюдается обычно при следующих состояниях:
1) сахарном диабете, остром панкреатите, панкреатических циррозах (эти заболевания дают гипергликемию, связанную с недостаточностью инсулина);
2) токсическом, травматическом, механическом раздражении центральной нервной системы. Травмы, опухоли мозга, а также эпилепсия, менингит, отравления ртутью, окисью углерода, синильной кислотой, эфиром дают так называемую центральную (нервную) гипергликемию;
3) при гипефункции щитовидной железы, коры и мозгового вещества надпочечников, гипофиза (в этом случае выделяется больше гипергликемических гормонов);
4) при сильных эмоциях и психическом возбуждении;
5) после обильного приема с пищей углеводов – алиментарная гипергликемия.
Гипогликемия – это снижение содержания глюкозы в крови. Встречается при:
1) передозировке инсулина (при лечении сахарного диабета);
2) заболеваниях почек, когда нарушается процесс реабсорбции в канальцах;
3) плохом всасывании углеводов вследствие заболевания тонкого кишечника;
4) недостаточной выработке гипергликемических гормонов;
5) при гиперфункции островков Лангерганса поджелудочной железы (аденомы, гиперплазии, гипертрофии);
6) при острых и хронических гепатитах, циррозах, дистрофии печени, механической желтухе, алкогольной интоксикации, при раке печени, отравлении фосфором, бензолом, хлороформом, мышьяком;
7) после больших потерь крови;
9) при спленомегалии (стойкое увеличение селезенки) у детей;
10) при несбалансированной диете (неправильном соотношении пищевых веществ), от недоедания и голода – алиментарная гипогликемия.
Глюкозурия – повышение глюкозы в моче. Глюкозурия наблюдается при сахарном диабете, синдроме Иценко-Кушинга, акромегалии, феохромацитоме, тиреотоксикозе, инсульте, энцефалите, травмах и опухолях головного мозга, гепатитах, циррозе, инфаркте миокарда, воспалении легких. Глюкозурия наблюдается также при заболеваниях почек, связанных с нарушением реабсорбции глюкозы в почечных канальцах, пиелонефрите, гломерулонефрите, нефросклерозе, почечном диабете, раке почек. Во всех перечисленных случаях концентрация глюкозы в крови превышает верхнее значение почечного порога 9,99 ммоль/л.
В моче здорового человека глюкоза практически не выявляется. Но может обнаружиться при некоторых физиологических состояниях (физиологическая глюкозурия): алиментарная глюкозурия, после психоэмоционального напряжения, при приеме лекарств (кофеина и других).