Главная | Обратная связь

Определение дихроизма полос поглощения

5.5.1. Особенности использования линейно поляризованного
света, при азимуте поляризации 0º или 90º.

Известно, что интенсивность полос поглощения МНПВО при оптимальном выборе условий получения спектров, определяемая экспериментально, связана с количеством исследуемого вещества следующим соотношением:

 

–ln R = αNd_эф = εCNd_эф (5.23)

где α – показатель поглощения вещества, см^-1;

ε – молярный коэффициент поглощения вещества в прозрачном растворителе, л/см·моль;

С – концентрация, моль/л;

R – коэффициент отражения, измеряемый в опыте;

d_эф – эффективная толщина исследуемого образца, см;

N – число отражений.

В свою очередь, эффективная толщина зависит от возмущения амплитуды электрического поля на границе раздела сред с различными показателями преломления. Для массивного образца, толщина которого намного больше глубины проникновения затухающего поля, в случае плоскополяризованного света для перпендикулярной и параллельной компонент имеем соответственно:

 

d_эф1 = 2d_р cosθ/(1 – n₂₁), (5.24)

d_эф2 = d_эф1{(2sin²θ – n₂₁)/[(1 + n₂₁)sin²θ – n₂₁]}d_р, (5.25)

где n₂₁ = n₂ /n₁ – относительный показатель преломления,

n₂ – показатель преломления вещества (в случае поглощения показатели преломления и поглощения связаны следующей зависимостью n₂ = n₁ – ik₂),

n₁ – показатель преломления материала элемента МНПВО,

θ – угол падения,

d_р – глубина проникновения затухающего поля.

Изучение ориентации молекул отдельных компонентов микроорганизмов на поверхности ИЭ может быть выполнено путем анализа интенсивности полос поглощения в спектре МНПВО, полученном при разной поляризации плоскополяризованного света для какого-нибудь из углов θ. Наиболее удобно выполнить этот анализ для θ = 45º, так как при этом в случае изотропного рапределения молекул 2d_эф1 = d_эф2, а среднее значение d_эф = (4 d_эф1 + d_эф2)/2 примерно равно d_р.

Оценка d_эф1,2 может быть проведена также по оптической плотности образцов из выражения:

D_1,2 = –lgRⁿ_1,2 = α N d_эф1,2 (5.26)

Отсюда следует вывод, что по изменению оптической плотности D_1,2 можно судить об изменениях эффективной толщины d_эф1,2 при разных направлениях поляризации источника излучения.

Перед проведением опыта необходимо было убедиться, что для выбранных экспериментальных условий выполняется последнее выражение. Использование этого выражения значительно облегчает аналитическую часть работы, т.к. позволяет воспользоваться линейной зависимостью D от величины d_эф.

Для более точной юстировки ИЭ под углом θ = 45º, кроме оптической юстировки, проверялось выполнение соотношения для изотропного образца для параллельной и перпендикулярной компонент электромагнитного поля световой волны R₁² = R₂.

В качестве поляризатора в ИК области использовался пленочный реплика-поляризатор на основе полиэтилена с 1200 штрихов/мм; степень поляризации составляла 96%; пропускание поляризатора 44%. Был произведен учет неполной поляризации света поляризатором.

При работе в режиме ТП световой поток пронизывает три среды: материал ИЭ с показателем преломления n₁, исследуемый объект с показателем преломления n₂, и среду за исследуемым объектом с показателем преломления n₃. Измерения могут быть выполнены и в том случае, когда n₁ < n₃.

В спектрофотометрии МНПВО для плоскополяризованного света при углах падения θ > θ_кр выражения для d_эф в случае тонкой пленки [(2πd / λ₁) < 0,1 и k₂ < 0,1] записываются в виде:

 

d_эф1 = 4n₂₁ d cosθ/(1 – n₃₁²) (5.27)

d_эф2 = {4n₂₁dcosθ[(1 – n₂₃^2/2)sin²θ – n₃₁²)]}/{(1 – n₃₁²)[(1 + n₃₁²)sin²θ – n₃₁²]}, (5.28)

где d – геометрическая толщина пленки;

n₂₁, n₃₁, n₃₂ – относительные показатели преломления;

n₁, n₂, n₃ – показатели преломления ИЭ, исследуемого объекта и воздуха соответственно.

Значение d_эф может в несколько раз превышать геометрическую толщину. Однако важно подчеркнуть, что при использовании спектроскопии МНПВО контраст спектра зависит не столько от d_эф, сколько от произведения ε·d_эф. Поскольку получаемая из опыта величина ε зависит от оптических свойств среды, в которой «растворена» исследуемая молекула, то интенсивность полос в спектре МНПВО будет зависеть от изменения показателя преломления в различных «срезах» (точках) образца. Подобный эффект влияния среды на молекулу известен в спектроскопии растворов.

Из представленных выражений следует, что в случае работы с тонкой пленкой величина d_эф2, может быть как больше, так и меньше d_эф1, в зависимости от того, будет ли отношение n₃₂²/ n₃₁² ¹ 1, соответственно. Это условие накладывает определенные требования на выбор материала ИЭ, поскольку в режиме ТП можно получить практически любой эффект, который можно отнести к дихроизму даже в случае его отсутствия.

Для эксперимента были использованы измерительные элементы, выполненные из Ge, инфракрасного стекла ИКС-25, AgCl и из PbF₂. При использовании первых двух ИЭ выполняется соотношение n₃₂²/ n₃₁² > 1, а при использовании других двух – выполняется соотношение n₃₂²/ n₃₁² < 1.

Полученные экспериментальные результаты показывают, что когда представленное отношение меньше 1 формулы для d_эф, полученные для слабопоглощающих объектов, лучше соответствуют полученным результатам, чем при выполнении другого условия. Данные, полученные с помощью элементов из AgCl и PbF₂ отличаются друг от друга примерно на 3%, причем отклонение от значений, вычисленных по аппроксимированным формулам для элемента из PbF₂ составило около 5%, а для измерений на элементе из AgCl – 8%. Результаты, полученные с помощью элементов из Ge и ИКС-25 отличаются примерно на 10%, причем отклонение от значений, вычисленных по аппроксимированным формулам для измерений на элементе из инфракрасного стекла ИКС-25 составило около 20%, а для измерений, выполненных на элементе из германия – 30%. Такое расхождение полученных результатов относительно результатов, вычисленных по формулам (5.27) и (5.28), можно объяснить трудностью получения идеального режима тонкой пленки в случае анализа неразрушенных волокон.

На практике может представиться, что объекты на рабочей поверхности ИЭ будут располагаться дискретно и в виде монослоя. Чтобы учесть возможность такого расположения объектов при количественных измерениях, следует выяснить, какому режиму работы (с МО или с ТП) будут соответствовать полученные результаты.

Запись спектров производилась с использованием ИЭ, которые применялись для работы с ТП и с использованием элементов из Ge и ИКС-24, которые были использованы для работы с МО. Для получения поляризованного света были использованы те же поляризаторы, что и в предыдущих экспериментах.

На основании полученных экспериментальных данных были вычислены отношения оптических плотностей для перпендикулярной и параллельной компонент плоскополяризованного света при угле падения 45º. Полученные отношения оптических плотностей при записи спектров на определенном измерительном элементе соответствуют отношениям оптических плотностей (при записи спектров на этом же элементе) в режиме МО или ТП. Следовательно, нарушения режима работы в рассматриваемом случае не наблюдается.

5.5.2. Особенности использования линейно поляризованного света,
при азимуте поляризации отличного от 0º или 90º.

Рассмотрим случай, когда при взаимодействии света с клетками при многократном отражении возникает разность фаз между параллельным и перпендикулярным компонентами плоскополяризованного света.

Если линейно поляризованный под углом 45º к плоскости падения свет попадает на полностью отражающую поверхность, то он разделяется при полном внутреннем отражении на две равные по интенсивности компоненты с взаимно перпендикулярной поляризацией и с разностью фаз, которая зависит от угла падения светового потока и показателя преломления материала призмы ПВО:

tg(φ/2) = (cosθ/sin²θ)(sin²θ – 1/n₁²)^1/2, (5.29)

При каждом дополнительном внутреннем отражении при тех же условиях разность фаз увеличивается на такую же величину. Таким образом, линейно поляризованный свет под углом 45º к плоскости падения, испытав полное внутреннее отражение, приобретая разность фаз между компонентами, становится эллиптически поляризованным. Когда разность фаз станет равной 90º, то свет становится поляризованным по кругу. Учитывая, что возможности метода НПВО, основанные на анализе эллиптической поляризации света, еще не выяснены, а вращение плоскости поляризации – является одним из экспериментальных методов исследования биологических объектов, то возможные эффекты, которые могут возникнуть при их взаимодействии со светом в режиме МНПВО при указанной поляризации источника излучения, необходимо учитывать при количественных измерениях.

Если изучают поглощающую среду, то при известных n₁, n₂, k₂ и θ величину φ можно определить из таблиц или с помощью ЭВМ из аналитических выражений.

Если считать, что материал, из которого изготовлен элемент МНПВО, свободен от всякого двулучепреломления, а разность фаз меняется с длиной волны, поскольку значение показателя преломления n₂₁ есть функция длины волны, то при малых значениях k₂ и θ > θ_кр величина φ слабо зависит от k₂, что позволяет оценить φ в приближении прозрачной среды (k₂ = 0).

Если расчет общего запаздывания разности фаз как функции длины волны для разных ИЭ с разным числом отражений для угла падения светового потока θ = 45º произвести с учетом принятых допущений, и если линейно поляризованный луч, азимут поляризации которого относительно плоскости падения составляет 45º, нормально падает на входную плоскость ИЭ МНПВО, то возникает разность фаз между компонентами, увеличивающаяся от отражения к отражению. Эта разность фаз при двух-трехкратном отражении достигает 90º, затем при увеличении числа отражений возрастает до 180º. Это означает, что вновь образуется линейно поляризованный луч, но направление его поляризации будет перпендикулярно направлению поляризации луча, падающего на входную площадь ИЭ МНПВО.

Можно также предположить, что разность фаз, полученная расчетным путем из рассмотренных выше выражений, в опыте будет отличаться, так как ПВО происходит на границе раздела двух сред, где низкопреломляющей средой являются такие сложные объекты как нативные клетки.

Зависимость изменения величины φ от числа отражений при азимуте поляризации 45º линейно поляризованного луча и параметров измерительного элемента МНПВО можно получить путем преобразования и других уравнений, приведенных в литературе.

Таким образом, при заданных значениях n₁, n₂, k₂ и θ можно рассчитать d_эф в зависимости от N. Результаты расчета относительного изменения d_эф от числа отражений в случае изотропного объекта представляют собой линейную зависимость, проходящую через начало координат и представляет зависимость относительного изменения d_эф от числа N, полученную из эксперимента для массивного образца клеток.

При азимуте поляризации 45º линейно поляризованного луча необходимо знать число отражений измерительного элемента и относительный показатель преломления. Только в этом случае измерения будут иметь физический смысл.

Следует также учитывать, что луч, попадающий на фотоприемник, несет в себе информацию, определяемую различной эллиптичностью, которая, в свою очередь, зависит от числа полных внутренних отражений, т.е. сигнал, который мы записываем с помощью регистрирующего устройства, представляет при многократном отражении сложную зависимость. Поэтому при количественных измерениях в режиме МНПВО следует работать не только с поляризованным источником излучения, но и точно знать азимут поляризации линейно поляризованного луча.