 |
|
Порівняйте прямі і непрямі методи підрахунку клітин мікроорганізмів у природних субстратах
Для визначення кількості мікроорганізмів використовують різні методи:
· прямий підрахунок під мікроскопом у рахувальних камерах (застосовується рідко);
· кількісний посів на щільні середовища з наступним підрахунком колоній, які виросли;
· титраційний посів на рідкі поживні середовища;
· спеціальні методи, які враховують особливості досліджуваного матеріалу.
Кількість санітарно-показових мікроорганізмів у досліджуваному матеріалі виражають у вигляді титру чи індексу. Титр - це найменший об'єм досліджуваного матеріалу (в мілілітрах) чи вагова кількість (у грамах), в яких виявлена одна клітина санітарно-мязового мікроорганізму. Індекс - кількість клітин санітарно-показового мікроорганізму в 1 л (і г) досліджуваного матеріалу.
Визначення мікробного числа є непрямим методом і дозволяє зробити висновок про можливе зараження досліджувано тварин. Кількість їх збільшується по мірі забруднення навколишнього середовища і зменшується при його самоочищенні. Таким чином, бактеріальна забрудненість субстрату, яка визначається цим методом, виявляється значно меншою, ніж за прямим підрахунком (не дають росту мертві клітини та живі, що втратили здатність розмножуватись; не ростуть термофіли та психрофіли, анаероби, гриби; не завжди розбиваються конгломерати, і одна колонія виростає із декількох клітин). .Кількість мікроорганізмів, які виростають на МПА виявляється в багато разів меншою, ніж їхній справжній вміст у досліджуваному об'єкті.
Існує кілька методів визначення загального мікробного числа: метод прямого підрахунку і метод кількісного посіву різних розведень зразків і проб досліджуваного об'єкта.
Прямий підрахунок мікроорганізмів у досліджуваному об'єкті проводиться під мікроскопом у рахувальних камерах Горяєва чи в камерах, спеціально сконструйованих для підрахунку бактерій. За допомогою цього методу визначають загальну кількість живих та мертвих клітин. Завчасно, досліджувану пробу обробляють так, щоб одержати гомогенну суспензію. Для полегшення підрахунку бактерій додають барвник, частіше за все еритрозин. Можна здійснювати прямий підрахунок і на мембранних фільтрах, через які пропускають речовину чи суспензію. Застосовується він у надзвичайних випадках, коли потрібна негайна відповідь відносно кількісного вмісту бактерій, наприклад, при аваріях систем водопостачання, оцінці ефективності роботи очисних споруд тощо. Метод простий і доступний для використання в санітарно-бактеріологічних лабораторіях, проте має ряд недоліків. За його допомогою важко відрізнити мікроорганізми від сторонніх часток, точно визначити кількість мікроорганізмів, оскільки вони часто утворюють великі скупчення (конгломерати), неможливо диференціювати живі мікроорганізми та мертві, санітарне значення яких неоднакове, важко підрахувати дрібні мікроорганізми.
Метод кількісного посіву досліджуваного матеріалу на щільні поживні середовища дозволяє підраховувати живі мікроорганізми. При визначенні мікробного числа виявляють, в основному, колонії мезофільних аеробних і факультативно-анаеробних бактерій, здатних розмножуватися на МПА, тобто використовувати білок і продукти його розщеплення як джерело азотного живлення. Ці мікроорганізми є основними споживачами органічних речовин, які вносяться до грунту та води з різними відходами промислових підприємств, виділеннями людей.
Посів за методом Коха використовується для визначення загальної кількості бактерій. У порожню стерильну чашку Петрі наливають 1 мл досліджуваного матеріалу з відповідного розведення і заливають 10-15 мл розплавленого, охолодженого до 45° С МПА, змішують з рідиною, обертаючи чашку на поверхні стола. Після застигання агару чашку перевертають кришкою вниз, культивують при 37° С протягом 24-48 годин чи при 22° - 72 години.
Колонії підраховують як на поверхні, так і в товщі агару, для чого чашку кладуть догори дном на чорний фон. Кожну колонію відмічають чорнилами. Оцінюють тільки ті чашки, на яких виросло від ЗО до 300 колоній. Якщо на чашці з найбільшим розведенням виросло понад 300 колоній і аналіз не можна повторити, то допускається підрахування колоній при сильному боковому освітленні за допомогою спеціальної пластинки з сіткою та лупи. Підраховується кількість не менше ніж у 20 квадратах площею 1 см2 у різних місцях чашки. Розраховується середня кількість колоній у 1 см2, яку помножують на площу чашки.
У результаті підрахунку колоній у кожній чашці визначають кількість бактерій на 1 мл (1 г) досліджуваного матеріалу з урахуванням розведення. За кількість бактерій приймають середнє арифметичне результатів підрахунку колоній на чашках з посівом двох сусідніх розведень.