Главная | Обратная связь

Технология триптофана

Триптофан является незаменимой аминокислотой. Среди других аминокислот триптофан отличается многообразием производных, широко используемых для производства фармакологических средств (лекарственные препараты для лечения ожирения, заболеваний печени, восстановления функций мозга, регулирования кровяного давления, лечения алкоголизма и др). Эффективно применение триптофана для обогащения низкокалорийной пищи и создания спецпитания для космонавтов. В небольших количествах триптофан используется в животноводстве. Повышению уровня использования триптофана в качестве пищевых и кормовых добавок препятствует его высокая цена. В то же время потребность в триптофане непрерывно возрастает.

В мировой производственной практике триптофан получают микробиологическим и химическим способами. Химический способ производства позволяет получать рацемическую форму аминокислоты из акрилонитрила (в Японии производится около 80 т триптофана в год этим способом). Однако разделение оптических изомеров дорогостоящая и трудоемкая операция. Микробиологический синтез позволяет получать L-форму аминокислоты, легкоусвояемую организмом человека и животных.

Путем микробного синтеза триптофан можно получить двумя способами. По первому способу осуществляют синтез триптофана с помощью мутантных штаммов бактерий, дефицитных по фенилаланину и тирозину. Для синтеза используются бактериальные штаммы, относящиеся к виду Bacillus subtilis, имеющие нарушения в цепи синтеза фенилаланина и тирозина.

Второй путь микробного синтеза триптофана – трансформация предшественника аминокислоты с помощью ферментных систем микроорганизмов до триптофана. В качестве предшественника используется антраниловая кислота. Особые штаммы дрожжей Candida utilis трансформируют антраниловую кислоту в индол-3-глицерофосфат, а затем с участием серина в присутствии фермента триптофансинтазы образуется триптофан.

 

 

В отечественной практике отработана технология получения L-триптофана из антраниловой кислоты с помощью ферментных систем дрожжей Candida utilis 295-t.

Для получения посевного материала дрожжи Candida utilis выращивают на питательной среде следующего состава (г/л): меласса – 100; мочевина – 5; K₂HPO₄ – 0,1; MgSO₄ – 0,05; CaCl₂ – 0,1. Величина рН среды 7,0–7,5, температура культивирования 28–30^оС.

Производственная питательная среда отличается от посевной тем, что содержание мелассы составляет 60 г/л. Ферментацию осуществляют в асептических условиях.

Процесс производственной ферментации можно разделить на два периода: накопление биомассы дрожжей и трансформация предшественника ферментными системами дрожжей в триптофан. Продолжительность периода накопления биомассы дрожжей составляет 24 ч при интенсивной аэрации (не менее 7 г О₂/л∙ч). Во втором периоде ферментации в КЖ небольшими порциями добавляют 5%-ный спиртовой раствор антраниловой кислоты и 50%-ный раствор мочевины. Антраниловую кислоту и мочевину вносят через каждые 6 ч. Через 3–4 ч после внесения антраниловой кислоты и мочевины с периодичностью в 12 ч дополнительно вносят мелассу в виде 25%-го стерильного раствора. Дробное внесение антраниловой кислоты связано с тем, что она токсична и содержание ее в среде не должно превышать уровня 0,5–0,7 г/л. В качестве предшественника можно использовать и другие соединения (например, индол), однако наибольший выход триптофана наблюдается при использовании антраниловой кислоты (до 98,8%).

Во втором периоде ферментации уровень аэрации снижается по сравнению с первым вдвое – до 3–4 г О₂/л∙ч. Длительность второго периода около 120 ч. Общая продолжительность процесса около 144 ч. Культуральная жидкость в конце ферментации содержит 7–12% сухих веществ, в том числе 0,3–0,6% триптофана (обычно 6 г/л).

Триптофан на 85–88% находится в жидкой фазе (КЖ). Для получения очищенного препарата триптофана используют фильтрат КЖ, для кормовых целей получают кормовой концентрат, в который входит и биомасса продуцента.

Для получения кормового концентрата триптофана культуральную жидкость упаривают под вакуумом в три раза и полученный концентрат высушивают в распылительной сушилке при температуре входящего теплоносителя 110–120^оС. Готовый продукт представляет собой порошок светло-коричневого цвета, имеющий следующий состав: сухое вещество – 90%; белковые вещества – 48–54%; триптофан – 1–3%; аминокислоты – 6% (в том числе лизин 3,22% от общей суммы аминокислот), витамины группы «В».

Очищенные препараты триптофана получают непосредственно из КЖ или из фильтрата КЖ ионообменным выделением.

Для этой цели используют двухколонный ионообменный аппарат: 1-я колонна заполнена анионитом ИА-1, а вторая – катионитом КУ 2-8. Цикл ионообменного выделения триптофана из КЖ включает следующие операции: сорбция триптофана на смоле ИА-1; промывка смолы водой; элюирование триптофана с анионита ИА-1 с одновременной сорбцией его на катионите КУ 2-8; элюирование триптофана с катионита; регенерация катионита КУ 2-8; регенерация анионита ИА-1.

КЖ в смеси со стоком от промывки ферментатора (5% от КЖ) подают на колонну со смолой ИА-1 снизу вверх со скоростью 1 об./об. смолы∙ч. Первая порция стоков (0,5 объема смолы) направляется в сборник промывной воды. Остальные стоки (отработанная КЖ) направляется на получение кормового белоксодержащего препарата (содержание триптофана менее 0,2 г/л). По окончании подачи КЖ на колонну подают (при тех же условиях) упаренный маточный раствор. На этой стадии отделяется биомасса продуцента, компоненты среды, кислые продукты метаболизма (окрашенные соединения сорбируются на смоле). Для вытеснения остатков КЖ из смолы производят кратковременную промывку анионита водой в количестве 0,5 об./об. смолы∙ч со скоростью 1 об./об. смолы∙ч в направлении снизу вверх.

Элюирование триптофана с анионита ИА-1 осуществляют водой. Для этого к выходу колонны со смолой ИА-1 подсоединяют колонну с катионитом КУ 2-8 и через 2-хколонный аппарат пропускают воду в количестве 5 об./об. смолы со скоростью 2 об./об. смолы∙ч. При этом триптофан, элюированный со смолы ИА-1, сорбируется на катионите КУ 2-8. Сток сливается в канализацию. Для полного элюирования триптофана производят циркуляцию воды, находящейся в системе, в течение суток. Затем колонны разъединяют и осуществляют элюирование триптофана со смолы КУ 2-8 и регенерацию анионита ИА-1. Элюентом является 1,6%-ный раствор NH₄OH в 50%-ном растворе этанола. Количество элюента – три объема катионита. Для приготовления элюента используют бедную фракцию элюата с предыдущего цикла и водно-спиртовый конденсат со стадии упаривания маточного раствора. Элюент подают в колонну сверху вниз со скоростью 1,5 об./об. смолы∙ч. Первый сток (1 объем смолы) – бедная фракция элюата. Богатая фракция (1,5 объема смолы) содержит 5–60 г/л триптофана. Последний сток (0,5 объема смолы) – бедная фракция. Бедная фракция используется для приготовления элюента.

По окончании элюирования катионит регенерируют 0,5 н. раствором НСl (4 объема смолы), подаваемым в колонну снизу вверх со скоростью 1 об./об. смолы∙ч. Катионит переводится в Н⁺-форму, сток направляется в канализацию.

Для регенерации анионита ИА-1 в колонну снизу вверх подают 3%-ный раствор NH₄OH (3 объема смолы со скоростью 1 об./об. смолы∙ч) и затем промывают водой (до 10 объемов смолы). Анионит переводится в ОНˉ-форму. Замену катионита и анионита в колоннах производят через 180–200 циклов работы колонн.

Богатую фракцию элюата нейтрализуют уксусной кислотой до рН 6,5–7,0, охлаждают до температуры 0–5^оС и выдерживают в течение 24 ч. Триптофан кристаллизуется в количестве до 80% от содержания в элюате. Кристаллы отделяют центрифугированием (влажность кристаллов до 70%) и затем высушивают в барабанной сушилке очищенным на фильтрах грубой и тонкой очистки воздухом, имеющим температуру 90–95^оС (температура отработанного воздуха 60–65^оС). Высушиваемый материал не должен прогреваться до температуры более 40^оС. Сухой продукт упаковывают в двойные полиэтиленовые пакеты (1–2 кг), которые помещают затем в бумажные или картонные мешки. Влажность продукта не более 5%. Содержание триптофана в конечном продукте не менее 90%.

Потери триптофана составляют: при сорбции на анионите ИА-1 – 3%; на стадии элюирования с анионита ИА-1 – 12%; при сорбции на катионите КУ 2-8 – 4%; на стадии элюирования с катионита КУ 2-8 – 3,5%; потери при сушке – 4%. Общий выход продукта 70%.

Сорбционная емкость по триптофану анионита ИА-1 и катионита КУ 2-8 составляет соответственно 64 и 60 кг/м³ влажной смолы.