 |
|
При определении активности ферментов всегда вначале готовят среду инкубации, регистрируют начальный уровень субстрата-маркера, и лишь затем, вводят фермент в реакционную смесь.
Другая ошибка - не понимают, что для последующего измерения надо все в камере заменить на свежее.
ПРИЛОЖЕНИЕ 2.
как готовить дрожжи?
-очень просто: взять 1-2 мл сухих дрожжей или 1 чайную (примерно)
ложку брикетированных дрожжей и развести в 5-20 мл 0.15М раствора КCl.
Не вредно будет использовать для разведения и среду инкубации 1% раствор глюкозы (или сахарозы, или что еще скажет преподаватель) в 0.15М КСl. Обязательно надо знать концентрацию клеточных тел в этой суспензии. Определять ее проще всего микроскопически с помощью счетной камеры.
ПРИЛОЖЕНИЕ 3.
как пользоваться счетными камерами?
В условиях практикума "биофизика клетки" концентрацию клеток в приготовленных суспензиях проще всего определять путем подсчета в камерах типа камеры Горяева или камеры Фукса-Розенталя. Возможно еще определение с автоматических счетчиков форменных элементов типа" Целлоскоп" или "Пикаскель". Однако, для автоматических счетчиков необходима специальная насадка с микро-отверстием калиброванного диаметра. Счетчики работают по принципу продавливания суспензии клеток через калиброванное отверстие с заданной скоростью. Подсчет частиц (клеток и т.п.) происходит электрометрическим методом, с автоматической регистрацией. Насадка давно украдена студентами, а самостоятельное изготовление такой насадки весьма затруднительно.
При работе со счетными камерами также есть аналогичные трудности - требуются специальные шлифованные покровные стекла. Академия давно не снабжается такими стеклами, а имевшийся на кафедре значительный запас также украден студентами, небольшое количество лежавшее непосредственно на рабочих местах практикума - раздавлено студентами. Тем не менее, данную трудность можно обойти, если учитывать принцип устройства счетной камеры.
Счетные камеры состоят из толстого предметного стекла с нанесенными поперечными прорезями, образующими три поперечно расположенные плоские площадки. Средняя площадка продольной прорезью разделена на две, каждая из которых имеет выгравированную на ней сетку. По обе стороны средней площадки в камере Горяева расположены две других на 0.1мм (в камере Фукса-Розенталя на 0.2 мм) выше средней. Плоскости этих площадок служат для ПРИТИРАНИЯ ПОКРОВНОГО СТЕКЛА ДО ПОЯВЛЕНИЯ так называемых НЬЮТОНОВЫХ КОЛЕЦ. После притирания покровного стекла создается камера, закрытая с двух боковых сторон, а с двух других остаются щели (капиллярные пространства, через которые и заполняют камеру.
Следовательно, если обычное покровное стекло достаточно плотно прижать к поверхности боковых площадок, то, в принципе, получим такой же зазор (0.1 или 0.2 мм). Иногда удается и притереть обычное покровное стекло к поверхности площадок до появления Ньютоновых колец, но чаще оно при этом просто давится. Кстати, чтобы притирать шлифованные или любые другие поверхности до такой степени слипания, поверхности должны быть хорошо обезжирены. Плотно прижать покровное стекло можно, если использовать дополнительные пружины препаратоводителя столика микроскопа.
Принцип сеток один и тот же. Они разделены на то или иное число квадратов, различным образом сгруппированных.
Постоянной величиной во всех сетках является "малый квадрат", Сетка камеры Горяева (рис.1а) содержит 225 больших квадратов - 15 рядов по 15 больших квадратов в каждом - разграфленных вертикально, горизонтально, крест на крест и неразграфленных.
Большие квадраты сетки Фукса-Розенталя (рис.1a) не разграфлены, сгруппированы по 16 квадратов, каждая группа ограничена тройными линиями.
Подсчет форменных элементов в камерах производят по формуле:
(7)
где: Х - количество форменных элементов в 1 мкл ( 1 мм3)
А - сумма всех сосчитанных форменных элементов
В - количество сосчитанных малых квадратов
С - разведение исходной суспензии (во сколько раз развели).
V - объем одного малого квадрата.
L - длина стороны малого квадрата
D - глубина камеры
Зачем надо разводить? - Исходная суспензия настолько концентрирована, что если ее не развести раз в 200, то сосчитать клетки невозможно, слишком густо в поле зрения.
Для разведения используют или МЕЛАНЖЕР от ГЕМОМЕТРА САЛИ или микродозатор.
При работе с камерами их рабочие поверхности должны быть чистыми и сухими.
К сухой счетной камере притирают сухое покровное стекло, а потом заполняют капиллярное пространство.
Кровь (или суспензию клеток) из пробирки берут или пипеткой или концом стеклянной палочки,: осторожно вносят каплю суспензии в торцевую щель капиллярного пространства. Камеру следует заполнять так, чтобы вся поверхность, на которой нанесена сетка была заполнена жидкостью без затекания ее в бороздки и без пузырьков воздуха.
После заполнения оставляют камеру на 1 минуту в покое для оседания форменных элементов. Затем камеру следует положить на столик микроскопа, КОТОРЫЙ ДОЛЖЕН БЫТЬ СТРОГО ГОРИЗОНТАЛЬНЫМ и приступают к подсчету форменных элементов при малом увеличении микроскопа (объектив х8, окуляр х10 или х15). Для лучшей визуализации стоит затемнить поле зрения - закрыть диафрагму или опустить конденсор.
В практикуме используется камера, которая сразу вделана в столик микроскопа, а покровное стекло можно не притирать - оно прижимается специальными пружинами.
В случаях, когда требуется большая точность, клетки считают на 2 сетках и результат берут среднеарифметический. Клетки считают в 5 больших квадратах (80 малых), расположенных по диагонали. Подсчету подлежат все клетки , лежащие внутри маленького квадрата, и те, которые находятся на левой и верхней линиях его или касаются их с той или другой стороны.Клетки, расположенные на правой и нижней линиях или касающиеся их с обеих сторон не считают, так как они будут сосчитаны в следующем квадрате. Результаты подсчета в каждом большом квадрате откладывают на 11 клавишном счетчике или записывают в столбик и затем суммируют.
МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КАМЕР
Сторона малого квадрата в камере Фукса-Розенталя - 0.25 ± 0.001 мм
Сторона большого квадрата - 1.0 ± 0.0015мм
Сторона сетки - 4 ± 0.005мм
Глубина камеры 0.2 ± 0.0005 мм
Сторона малого квадрата в камере Горяева - 0.05 ± 0.001мм
Сторона большого квадрата - 0.2 ± 0.0015мм
Сторона сетки - 3 ± 0.005мм
Глубина камеры - 0.1 ± 0.008мм
При соблюдении описанного режиме подсчета и соблюдении метрологических характеристик камеры ошибка достигает 2 - 3%
ПРИЛОЖЕНИЕ 4.
таблицы растворимости кислорода в воде, в зависимости от температуры раствора. Давление воздуха 760 мм.рт.ст., парциальное давление кислорода 159 мм.рт.ст. концентрация соли 0.15М (КСl или NaCl)
| Температура | ||||||||
| Кщэф.растворимости. | .034 | .0333 | .0327 | .0321 | .0315 | .0310 | .0304 | .0300 |
| Температура | ||||||||
| Коэф.раств. | .0294 | .0289 | .0284 | .0279 | .0275 | .0271 | .0266 | .0262 |
| Температура | ||||||||
| Коэф.раств. | .0275 | .0254 | .0251 | .0248 | .0245 | .0242 | .0239 | .0237 |
| температура | ||||||||
| коэф.раств. | .0234 | .0231 |
как пользоваться коэффициентом растворимости или какова его размерность?
размерность коэффициентов - относительные единицы, а чтобы найти сколько мг кислорода растворено в 1 литре воды при данной температуре необходимо взять коэффициент растворимости для данной температуры и умножить его на 303.
Пример: какова растворимость кислорода в воде при 33 градусах? ответ: в воде при данной температуре растворяется при парциальном давлении кислорода 159 мм.рт.ст. 0.0251*303 мг кислорода, или 7.6356 мг кислорода/литр. или 0.0002386 М.