Главная | Обратная связь

Ход микробиологического исследования при выделении и идентификации пневмококков.

Первичный посев материала производят только на кровяной агар. В качестве основы питательной среды используют сердечно-мозговой агар либо эритрит-агар, к которым добавляют 5-7% крови, 15-20% лошадиной сыворотки и 1-2% дрожжевого экстракта. Кровь засевают в сердечно-мозговой бульон. Материал из респираторного тракта предварительно гомогенизируют химическим способом, смешивая его с муколитиком N-ацетил-L-цистеином, либо механическим способом с помощью миксера. В итоге получают гомогенат в рабочем разведении 1:10, посев которого производят количественным методом. Чашки инкубируют при температуре 37°С в атмосфере с 5-10%. СО, в течение 18-24 ч.

После инкубации чашки просматривают с использованием лупы, выявляют характерные для пневмококка колонии с а-гемолизом и производят их пересев частыми штрихами на сектора чашки с кровяным агаром для выделения и накопления чистой культуры. При необходимости из колоний готовят окрашенные по Граму мазки и микроскопируют.

Дальнейшее изучение выделенных чистых культур предусматривает установление видовой принадлежности, определение сероварианта и чувствительности к антибиотикам. Иногда определяют вирулентность пневмококка в опыте на белых мышах.

Идентификацию пневмококка осуществляют по совокупности морфологических, физиологических, культуральных, серологических и биохимических свойств. Для дифференциации пневмококка от других видов зеленящих стрептококков используют два основных теста - лизис желчью или дезоксихолатами и чувствительность к оптохину (этилгидрокупреина гидрохлориду).

Тест лизиса желчью. Основан на способности 10% р-ра желчи крупного рогатого скота и 2% р-ра дезоксихолата или таурохолата натрия лизировать молодую культуру пневмококка. Желчь понижает поверхностное натяжение между бактериальной мембраной и средой, что ведет к ускорению естественного аутолитического процесса. Постановку теста осуществляют либо в жидкой среде, когда в две пробирки, одна из которых опытная, содержащая 10% желчный бульон, другая - контрольная с сывороточным бульоном, вносится испытуемая бульонная культура и выдерживается до часа, либо на плотной среде путем нанесения на газонный рост или изолированные колонии капли желчного бульона (дезоксихолата) и выдерживания, пока не высохнет капля (5-10 мин).

При лизисе пневмококка на жидкой среде отмечается просветление в опытной пробирке; на плотной среде на месте капли рост уплотняется или исчезает совсем. Рост стрептококков остается интактным.

Оптохиновый тест. Тест основан на различной чувствительности пневмококка и зеленящих стрептококков к оптохину. Рост пневмококка ингибируется концентрациями оптохина не более 5 мкг/мл. При применении бумажных дисков, импрегнированных оптохином, которые накладывают на инокулированные штрихом чашки с кровяным агаром, зона ингибирования роста S.pneumoniae после 18-часовой инкубации, значительно превышает зону ингибирования роста стрептококков.

Серотипирование пневмококков. Антигенную структуру пневмокков изучают в реакции агглютинации на стекле или в реакции Найфельда с использованием набора сывороток к капсульным полисахаридам. Набор состоит из ”omni”-сыворотки (антитела ко всем 84 сероварам), поливалентных пуловых сывороток, содержащих антитела к 4-7 сероварам и серогруппам, имеющим буквенное обозначение (от "А» до ''I"), и типовых сывороток, входящих в пулы. Идентификация может быть также осуществлена с использованием коммерческих реагентов для реакции коагглютинации

Пневмококк и другие стрептококки группы.В, зеленящие и энтерококки идентифицируют по характеру гемолиза на 5%КА, по их отношению к желчи, нагреванию до 45˚С, повышенному содержанию NaCl (6,5%).

Streptococcus pneumoniae

· дает ά-гемолиз на КА,

· лизируется желчью,

· не растет на простом агаре,

· не растет в присутствии 6,5%NaCl,

· не растет в присутствии 0,25% оптохина,

· не растет при 45˚С.

Для него характерны отрицательный САМР-тест и отрицательный тест на гидролиз гиппурата Na.

Streptococcus agalactiae (гр.В)

· растет на простом МПА,

· растет на бульоне с 6,5% NaCl хотя и слабо,

· растет в присутствии оптохина и желчи,

· не растет при 45˚С.

S.agalactiae дает положительный САМР-тест, гидролизует гиппурат Na, дает β-гемолиз.

Зеленящие и энтерококки

· дают α-гемолиз,

· растут при 45˚С,

· растут в присутствии оптохина,

· растут в присутствии желчи,

· растут в присутствии NaCl 6,5%.

От S.agalactiae их отличает тип гемолиза, отрицательная проба на гидролиз гиппурата Na и отрицательный САМР-тест.