 |
|
Тема 3.1. Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы
Цель занятия:изучения влияния факторов внешней среды (освещения, влажности, температуры, состава воздуха ) на рост микроорганизмов
Оснащение занятия . На рабочее место для студентов необходимо подготовить микроскоп; матерчатые и марлевые салфетки, чашку Петри с 3 кубиками (по 1 см) белого хлеба разной влажности (сухой 15%, с влажностью 30 и 60%); культуры микроорганизмов (кишечную палочку, сенную палочку, дрожжи, мукор, сарцину) на питательных средах в пробирках; пробирку со столбиком МПА и со столбиком среды Эндо; 2 пробирки с MПБ; 1 пробирку с 10 мл среды Виноградского для анаэробного фиксатора азота Clostridium pasteuriаnum, стерильную резиновую пробку для закрытия этой пробирки после посева; 3 чашки Петри со средой МПА; 3 чашки Петри со средой Эндо; физраствор в 2 пробирках по 2 мл и 4 по 1 мл; почву (любую) в чашке Петри; бактериологическую петлю; препаровальную иглу; спиртовку; карандаш по стеклу; предметные стекла; кристаллики поваренной соли на часовом стекле; антибиотики в дискаx; лук, чеснок, терку для них; шпатели стеклянные; пинцет; ланцет; кусочки или буквы из темной бумаги; ультрафиолетовую лампу; пипетки стерильные на 1 мл.
Влажность
Микроорганизмы хорошо развиваются в субстрате при влажности 20-30%. Очень чувствительны к недостатку влаги неспорообразующие бактерии. Наиболее устойчивы к высушиванию споры бацилл и плесневых грибов.
Ход работы. Использовать 3 чашки Петри. В 1 чашку положить 3 ломтика хлеба естественной влажности. На 1-й ломтик, кубик посеять бактериологической петлей бактерию или кокка, на 2-й - бациллы, на 3-й - плесневый гриб.
Во 2-ю чашку положить 3 подсушенных кусочка и также сделать посев бактерий, бацилл и грибов на каждый кусочек отдельно.
В 3-ю чашку положить 3 кубика хлеба, увлажнив их обильно стерильной водой, и снова сделать посев бактерий, бацилл и грибов. Чашки с естественной влажностью и с увлажнением кубиков хлеба до 60% поставить в термостат в закрытом эксикаторе, на дно которого налита вода. Вместо эксикатора можно использовать целлофановый пакет, но с отверстиями для поступления воздуха.
Рост микроорганизмов на влажном хлебе появится через 1-2 дня.
На следующем занятии отметить степень развития каждой группы микроорганизмов на субстрате с разной влажностью. Сделать вывод о большей устойчивости плесневых грибов к недостатку влаги по сравнению с бактериями или кокками.
Результаты записать в тетрадь, привести таблицу интенсивности роста (табл. 1).
Таблица 1- Интенсивность роста микроорганизмов
| Микроорганизмы | Влажность субстрата | ||
| контроль, 30% | опыт,15% | опыт, 60% | |
| Бактерии или кокки | |||
| Бациллы | |||
| Плесневые грибы |
Температура
По отношению к температуре микроорганизмы делятся на психрофилов - оптимальная температура 5…10°С, мезофилов - 25…37°С и термофилов - 45…60°С. Все микроорганизмы культивируют только при оптимальной температуре.
Низкая температура, как правило, не уничтожает микроорганизмы, а задерживает обменные процессы в их клетках. Высокая температура действует на них губительно. Все клетки микроорганизмов погибают в основном при 50…70°С. Споры микроорганизмов выдерживают нагревание до 80…100°С и более в течение нескольких часов.
Сохраняясь в продуктах, микроорганизмы наносят нам огромный вред. Поэтому установление летальной температуры для микроорганизмов очень важно для практических условий.
Ход работы.
1.Взять культуру кишечной палочки с косячка со средой Эндо бактериологической петлей и сделать взвесь в пробирке с 2 мл физраствора. Подготовить чашку со средой Эндо. Для этого наружную сторону дна чашки расчертить на 3 сектора карандашом по стеклу и обозначить их 1, 2, 3. Одну петлю из приготовленной взвеси кишечной палочки посеять штрихом в сектор 1. Это и будет контроль - рост культуры без нагревания. Затем взвесь культуры в пробирке с физраствором над спиртовкой довести до кипения, т.е. до появления первых пузырьков и сделать посев штрихом в сектор 2. Эту же взвесь культуры в пробирке прокипятить 5 мин над спиртовкой (в слабом пламени) и сделать посев штрихом в сектор 3.
2.Культуру сенной или картофельной палочки взять из пробирки на МПА, сделать взвесь в физрастворе и затем последовательно провести все операции, что и с культурой кишечной палочки, но посев делать на чашки с МПА в сектора 1, 2, 3.
3.Чашки Петри перевернуть вниз крышками и поставить в термостат с температурой 37°С для кишечной палочки и 25…30°С - для сенной.
На следующем занятии результаты записать в тетрадь, оформить табл.2.
Таблица 2-. Влияние температуры на микроорганизмы
| Бактерии | Контроль, без нагревания | Опыт, время кипячения, мин | |
| Кишечная палочка | |||
| Сенная палочка |
Примечание. Интенсивность роста микроорганизмов обозначить: (+++) - сильный рост; (++) - средний, (+)- слабый; 0 - роста нет.
Кислород
По отношению к кислороду микроорганизмы делятся на аэробов и анаэробов. Между ними существуют промежуточные формы, которые могут развиваться как в присутствии, так и в отсутствие кислорода воздуха.
Это факультативные аэробы или анаэробы. Например , некоторые дрожжи в зависимости от наличия или отсутствия кислорода воздуха осуществляют аэробное дыхание или брожение.
Кислород используют все микроорганизмы. Разница состоит в источнике поступления кислорода. Аэробы для окисления органических соединений получают кислород из воздуха, анаэробы же получают кислород и энергию при разложении сложных органических соединений в отсутствие свободного кислорода воздуха. Для них кислород воздуха токсичен или вызывает гибель клеток.
Ход работы
Для аэробов необходимо создать условия, обеспечивающие постоянное поступление в среду кислорода воздуха. Их выращивают на поверхности плотных питательных сред или в тонком слое жидкой среды. Можно выращивать аэробы и в высоком слое жидкой среды, но при непрерывной аэрации (метод глубинной культуры). Этот метод используют в производстве для получения биомассы микроорганизмов или их метаболитов.
Наиболее простой и широко распространенный в лабораторной практике способ глубинного культивирования - выращивание на качалках, обеспечивающих вращение колб или пробирок с культурами со скоростью 100-200 оборотов в минуту.
Продувание среды кислородом не рекомендуется, так как чрезмерное насыщение среды кислородом (до 40 мг/л) ведет к угнетению роста микроорганизмов.
Условием для выращивания анаэробов является отсутствие кислорода воздуха, поэтому его нужно удалить. Наиболее эффективный способ - выращивание в высоком слое среды. Среду для анаэробов берут свежеприготовленную, чтобы в ней не успел раствориться кислород, и вносят посевной материал на дно. Если среда простерилизована давно, её нужно прокипятить перед употреблением и быстро охладить для удаления кислорода воздуха. Можно поверхность среды для анаэробов залить слоем вазелинового масла или жидким водным агаром и закрыть стерильной резиновой или притертой стеклянной пробкой.
Выращивают анаэробы и в толще агаризованной среды. Культуру анаэроба следует внести в расплавленную и остуженную до 40°С агаризованную среду в пробирке, тщательно размешать и набрать в стерильную длинную стеклянную трубку, один конец которой закрыт стерильной ватой, а другой необходимо залить парафином после посева культуры. Можно выращивать анаэробы и в специальном лабораторном приборе - анаэростате, из которого отсасывается воздух.
Ход работы
1.В столбик с МПА провести посев уколом по центру среды до дна пробирки культуры сенной или картофельной палочки. Для этого пробирку держат вверх дном над спиртовкой, вынимают пробку и стерильной петлей с захваченным в ней из другой пробирки посевным материалом, осторожно делают укол. Выращивать при температуре 25°С.
2.В столбик с агаром Эндо таким же образом провести посев кишечной палочки и выращивать при 37°С.
3.На следующем занятии по характеру роста микроорганизмов (гвоздик шляпкой вверх - аэроб, гвоздик шляпкой вниз - анаэроб, по всему штриху - факультативный анаэроб) нужно определить их отношение к кислороду.
4.В одну пробирку с МПБ провести посев сенной палочки, в другую - кишечной. Выращивать в термостате соответственно при 25°С и 37°С.
5.На следующем занятии по характеру роста микроорганизмов на бульоне определить их отношение к кислороду (рост пленкой на поверхности - аэроб, равномерное помутнение или пристеночные хлопья - факультативный анаэроб, осадок на дне пробирки - анаэроб).
6.Для выращивания анаэробных азотфиксирующих микроорганизмов (Clostridium pasteurianum) в пробирку, содержащую 100 мг мела и высокий слой (10 мл) свежеприготовленной жидкой среды Винорадского, внести небольшое количество почвы. Закрыть пробирку стерильной резиновой пробкой и поставить в термостат с температурой 25…30°С. Через несколько дней поверхность жидкости покроется пленкой аэробов, выросших за счет остаточного кислорода в пробирке, а на дне начнется масляно-кислое брожение с обильным газообразованием.
7.На следующем занятии записать характер газообразования и сделать мазок-препарат из осадка. Для распознавания анаэробных клостридиев провести окраску капли жидкости йодом. Клетки масляно-кислых клостридиев содержат гранулезу, которая с йодом дает фиолетовое окрашивание.
Результаты записать в тетрадь в виде таблицы (табл. 3).
Таблица 3- . Отношение микроорганизмов к кислороду
| Микроорганизмы | Характер роста | Отношение к кислороду |
| 1 – й опыт | ||
| Кишечная палочка | ||
| Сенная палочка | ||
| 2 – й опыт , в жидкой среде | ||
| Кишечная палочка | ||
| Сенная палочка | ||
| 3 – й опыт , в жидкой среде для клостридиев | ||
| Анаэробный фиксатор азота |
Осмотическое давление
Между микроорганизмами и окружающей средой совершается непрерывный обмен веществ. Интенсивность его определяется комплексом факторов, в том числе и концентрацией раствора. Клетка функционирует нормально, если находится в состоянии тургора, т.е. когда концентрация раствора в клетке и вне её равны. При высокой концентрации раствора вне клетки наступает её плазмолиз, т.е. обезвоживание и гибель.
Ход работы
Пекарские дрожжи развести в 1 мл стерильной дистиллированной воды до очень слабой суспензии.
Каплю суспензии поместить на предметное стекло и внести в неё несколько кристалликов поваренной соли или сахара. Закрыть препарат покровным стеклом.
Дать препарату постоять 5 мин.
Микроскопировать с увеличением 15´60 или капнуть капельку кедрового масла на покровное стекло и смотреть с иммерсией.
В клетках дрожжей отмечается явление плазмолиза, т.е. протоплазма отходит от оболочки и сжимается.
Антибиотики и фитонциды
Слово «антибиотик» происходит от двух слов: «анти» - против, «биос» - жизнь. В отличие от других химических ядов (спирты, органические кислоты, соли тяжелых металлов) антибиотики обладают избирательным действием на микроорганизмы.
Антибиотическим действием обладают и летучие вещества, выделяемые растениями. Они называются фитонцидами.
Ход работы
1. На поверхность застывшего МПА в чашке Петри нанести петлей широкий штрих картофельной палочки (Mesentericus). Перпендикулярно к ней параллельными штрихами посеять грибовидную палочку (Bacillus mycoides) и желтую сарцину (Sarcina flavus). Затем чашки с посевами поставить в термостат с температурой 25…30°С.
На следующем занятии отметить результаты опыта.
Картофельная палочка выделяет антибиотики и угнетает рост грибовидной палочки и сарцины. Поэтому в непосредственной близости от штриха картофельной палочки роста этих культур не будет, на некотором расстоянии слабый рост, а дальше от штриха - нормальный.
2. Приготовить суспензию кишечной палочки в 1 мл физраствора. Нанести капельку суспензии в центр чашки Петри со средой Эндо и растереть шпателем по всей поверхности среды. Можно сделать посев густыми штрихами по всей поверхности среды в двух взаимно перпендикулярных направлениях, взяв материал из суспензии бактериологической петлей.
В разных местах на поверхности засеянной среды положить 3 бумажных диска, пропитанных разными антибиотиками, мелко свеженатёртые лук и чеснок. С обратной стороны чашки (на дне) сделать пометки секторов: 1, 2, 3, 4, 5 и записать, что в них внесено. Например: сектор 1 - мономицин, сектор 2 - левомицетин, сектор 3 - эритромицин, сектор 4 -лук, сектор 5 - чеснок.
Чашки перевернуть вверх дном и поставить в термостат при 37°С. На следующем занятии провести учет посевов. Если антибиотики и фитонциды подавляют взятую культуру микроорганизмов, то вокруг диска образуется светлая зона задержки роста.
Приготовить суспензию сенной палочки в 1 мл физраствора и нанести капельку её в центр чашки Петри со средой МПА. Проделать те же операции, что и с кишечной палочкой в пункте 2. Выращивать при температуре 25…30°.
На следующем занятии результаты записать в тетрадь в виде таблицы (табл. 4).
Таблица4-. Влияние антибиотиков и фитонцидов на микроорганизмы
| Бактерии | Зона задержки роста | ||||
| мономицин | левомицетин | эритромицин | лук | чеснок | |
| Кишечная палочка | |||||
| Сенная палочка |
Отметить избирательность действия антибиотиков и фитонцидов на микроорганизмы.
Ультрафиолетовые лучи
Свет обладает неодинаковым действием на микроорганизмы. Рассеянный свет не оказывает заметного влияния на большинство бактерий. Сильным бактерицидным (губительным) действием обладают ультрафиолетовые лучи. Поэтому их используют для дезинфекции воздуха в лабораториях, животноводческих помещениях, операционных и других закрытых помещениях, где необходимо уничтожить микроорганизмы.
Ход работы
Петлю культуры кишечной палочки, взятую из пробирки с косячка на среде Эндо, перенести в пробирку с 1 мл физраствора.
Приготовить в пробирке с физраствором густую взвесь кишечной палочки, тщательно размешав взятую культуру.
Из этой взвеси сделать посев густым штрихом бактериологической петлей на поверхность среды Эндо в чашке Петри или 1 каплю взвеси нанести на поверхность среды в центр чашки со средой Эндо и растереть по всей поверхности шпателем.
На засеянную поверхность нанести пинцетом стерильные кусочки темной бумаги, не пропускающей свет.
Чашки открыть и поставить под лампу ультрафиолетового света на 10 мин на расстоянии 20 см.
Стерильным пинцетом убрать кусочек темной бумаги.
Чашку перевернуть вверх дном и поставить в термостат с температурой 37°С.
Для сопоставления результатов необходимо аналогичный опыт поставить со спорообразующей культурой бактерий - сенной или картофельной палочкой, посеяв их на среде МПА.На следующем занятии провести учет и результаты записать в виде таблицы (табл.5).
Таблица 5-. Влияние ультрафиолетовых лучей на микроорганизмы
| Бактерии | Контроль, рост под кусочком темной бумаги | Опыт, рост в чашке после действия ультрафиолетового света |
| Сенная палочка | ||
| Кишечная палочка |
Примечание.Иинтенсивность роста обозначить: (+++)- сильный рост; (++)- средний; (+) слабы; 0 - роста нет.
Сопоставить устойчивость к факторам среды спорообразующих и неспорообразующих бактерий.
Контрольные вопросы
Влияние влажности на микроорганизмы.
2.Влияние температуры на микроорганизмы.
3.Отношение микроорганизмов к кислороду.
4.Влияние осмотического давления на микроорганизмы.
5.Влияе антибиотиков и фитанцидов на рост мироорганзмов.
6. Влияние ультфяиолетовых лучей на митроорганизмы.