Главная | Обратная связь

Опыт 18. Количественное определение белка методом Лоури

Реагент. В 500 мл воды растворяют 1,5 г СuSO₄∙5Н₂O и 6 г

натрия-калия тартрата (NaKC₄Н₄О₆∙4Н₂O). При интенсивном перемешивании добавляют 300 мл 10%-ного (масс./об.) раствора едкого натра и 1 г йодида калия..Объём смеси доводят до 1 л водой. Раствор хранят в пластиковой бутылке.

Методика. Смешивают 4,0 мл биуретового реагента и 1,0 мл раствора белка, разбавленного в случае необходимости до концентрации 1:10 мг/мл белка; выдерживают смесь при комнатной температуре в течение 30 мин. Определяют оптическую плотность раствора при длине волны между 540 и 560 нм. Концентрацию белка определяют с помощью градуировочного графика, построенного с использованием 5 растворов яичного альбумина с концентрациями 2, 4, 6, 8 и 10 мг/мл

Определению белка этим методом мешают пептиды, сахароза, желчные пигменты, которые дают окраску в биуретовой реакции; соли аммония, трис и глицерин, которые оказывают влияние на окраску, даваемую белками; липиды и детергенты, которые могут вызвать помутнение.

Опыт 19. Количественное определение белка методом Лоури -

Фолина

Реагенты

Раствор А – 2%-ный раствор Na₂СО₃ в 0,1 М NaОН.

Раствор Б – 0,5%-ный раствор СuSО₄∙5Н₂О в 1%-ном растворе

NaKC₄Н₄О₆∙4Н₂O.

Раствор В – смешивают 50 мл раствора А с 1 мл раствора Б перед

применением.

Раствор Г – Коммерческий или приготовленный стандартный реагент Фолина – Чиокалтеу*, разбавленный водой вдвое.

* Методика приготовления реагента Фолина – Чиокалтеу.

Метод А. 100 г вольфрамата натрия (Na₂WО₄∙2Н₂O) и 25 г молибдата натрия (Na₂MoО₄∙2Н₂O) растворяют в 700 мл воды, добавляют 50 мл 85%-ной фосфорной кислоты и 100 мл концентрированной хлористоводородной кислоты. Смесь дефлегмируют 10 ч (вытяжной шкаф), слегка охлаждают, убирают обратный холодильник, добавляют 150 г сульфата лития, 50 мл воды и 5 капель бромной воды. Смесь нагревают до кипения и кипятят 15 мин до удаления брома. Охлаждают до комнатной температуры, количественно переносят в мерную колбу емкостью 1 л и доводят водой до метки. При необходимости раствор фильтруют.

Метод Б. В круглодонную колбу помещают 70 мл воды, 10 г вольфрамата натрия, 2,5 г фосфорномолибденовой кислоты (Н₇Р(Мо₂О₇)₆∙Н₂О), 5 мл 85%-ной фосфорной кислоты, кипятят с обратным холодильником 2 ч, охлаждают, разбавляют водой до 100 мл, хорошо перемешивают и при необходимости фильтруют.

В темной склянке с притертой пробкой раствор может храниться в холодильнике длительное время. Внешний вид качественного реактива – прозрачный раствор ярко-желтого цвета.

Методика. Смешивают К 1,0 мл раствора белка, разбавленного в случае необходимости до концентрации 50 – 500 мкг/мл белка; добавляют 5,0 мл раствора В, хорошо перемешивают и выдерживают в течение 10 мин при комнатной температуре. Быстро при постоянном перемешивании добавляют 0,5 мл раствора Г, выдерживают 30 мин при комнатной температуре, а затем измеряют оптическую плотность раствора при 750 нм.

Концентрацию белка определяют по градуировочному графику, построенному с помощью яичного альбумина.

Определению белка этим методом мешают вещества, перечисленные выше в методе Лоури, а также тирозин, триптофан, фенольные, тиольные соединения и другие восстановители.