Главная | Обратная связь

Приготовление бактериальных препаратов для микроскопирования

Цель занятия: Закрепить и углубить знания студентов по морфологии бактерий; освоить технику приготовления бактериальных препаратов.

Задание 2.Изучить технику приготовления бактериальных препаратов

Правила приготовления мазка-препарата. Морфологию микроорганизмов изучают в живом состоянии и в окрашенных препаратах. Существуют простые и сложные методы окраски. При простом методе окраски используется один краситель (фуксин, метиленовая синь, генцианвиолет и др.). При сложном методе окраски одновременно используются несколько разных красителей.

При любом способе окраски мазок - препарат готовят следующим образом:

1.Обезжирить предметное стекло, натерев его с обеих сторон кусочком хозяйственного мыла и протерев затем сухой салфеткой, так как только на обезжиренном стекле суспензия микроорганизмов хорошо растекается. Чаще всего обезжиривание предметных стекол проводят абсолютным спиртом или в смеси равных объемов спирта и эфира. Кладут стекло перед собой на темную поверхность (на стол).

2.Обожженной петлей на середину стекла нанести 2-3 капли физиологического раствора или суспензию культуры с жидкой среды.

 

3.С косого агара или с другого субстрата профламбированной бактериологической петлей взять культуру объемом с маковое зернышко и внести в каплю физиологического раствора. Взятие культуры из пробирки производят над пламенем спиртовки.

4.Размазать культуру тонким слоем по стеклу овалом не более 2 см². Обжечь петлю и поставить в стакан. Обвести место мазка восковым карандашом, снизу стекла.

5.Мазок высушить на воздухе.

6.Зафиксировать сухой мазок. Существуют 2 метода фиксации: термический и химический (спиртом, парами осмиевой кислоты и др.). Самым распространенным является термический метод, когда мазок фиксируют над пламенем горелки в течение 3 с. Стекло проводят над верхним пламенем спиртовки круговыми движениями 3-4 раза мазком вверх. Надежность фиксации проверяют, приложив стекло к тыльной стороне ладони - стекло должно быть теплым. В случае перегрева морфология бактерий исказится, так как произойдет свертывание белка, а в случае недогрева мазок смоется со стекла при дальнейших манипуляциях. Фиксация необходима , чтобы убить микроорганизмы и сделать их безопасными для работы; закрепить микроорганизмы на стекле, чтобы они не смылись затем при окраске; мертвые клетки лучше воспринимают окраску, чем живые.

1. Покрасить простым или сложным методом.

2. Мазок высушить между листами фильтровальной бумаги.

3. Рассмотреть препарат в микроскоп при сухих объективах.

4. Капнуть на мазок каплю кедрового масла или глицерина.

5. Рассмотреть в микроскоп через иммерсионный объектив.

Простые методы окраски микробиальных препаратов Для окраски клеток микроорганизмов наиболее пригодными являются анилиновые краски (основные и нейтральные). При простом методе окраски приготовленный и зафиксированный мазок-препарат размещают над ванночкой на стеклянном мостике, мазком вверх. Из капельницы на мазок наносят одну анилиновую краску (синьку Леффлера или фуксин) и оставляют её на препарате 2-4 мин. Краситель можно налить и не прямо на мазок, а на кусочек фильтровальной бумаги, размещенной на мазке. Окраска получается чище. Через 2-4 мин смывают краску с препарата тонкой струёй воды и высушивают препарат между листами фильтровальной бумаги. Затем мазок микроскопируют с применением иммерсии. При простых методах окраски можно увидеть форму и расположение микроорганизмов, их относительные размеры, наличие капсул.

Капсула - это слизистый слой, окружающий клетки отдельных бактерий. Она является продуктом жизнедеятельности клетки и состоит из различных полисахаридов или полипептидов. Капсула служит средством защиты или запасным питательным материалом клетки.

Наиболее распространена окраска капсул по методу Михина. На фиксированный препарат наносят метиленовую синь и красят ею в течение 3 мин при подогревании. Краску сливают, промывают препарат водой, просушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсией. Тело клеток окрашивается в синий цвет, капсула - почти бесцветна или бледно-розовая.

Сложные методы окраски. Для дифференциации микроорганизмов и изучения их клеточной структуры применяются сложные методы окраски, например, окраска по Граму или окраска спор. Впервые в 1884 г. датский физик Х.Грам предложил использовать сложный метод окраски, основанный на разной восприимчивости бактерий к одним и тем же красителям. Этот метод применяется широко и в настоящее время и называется методом окраски по Граму.

Сущность окраски по Граму заключается в том, что краски трифенилметанового ряда (например, генцианвиолет, метилвиолет и др.) при соединении с йодом в присутствии магниевой соли рибонуклеиновой кислоты, мукополисахаридов и полифосфатнуклеотидов, которые содержатся в наружном слое цитоплазмы и клеточной стенке бактерий, образуют комплекс, плохо растворимый в спирте. К таким бактериям относятся грамположительные бактерии «Г+» (кокки, бациллы, актиномицеты, молочно-кислые бактерии, дрожжи). Клеточная стенка у этих бактерий состоит из многослойного муреина (мукополисахариды и полифосфатнуклеотиды), содержание которого колеблется от 50 до 95%. После окраски их генцианвиолетом и обработки раствором Люголя (йод в водном растворе йодистого калия) они сохраняют фиолетовый цвет (цвет генцианвиолета), несмотря на дополнительную обработку спиртом.

У грамотрицательных «Г-» бактерий клеточная стенка состоит из однослойного муреина. Его содержание колеблется от 5 до 12%. Генцианвиолет и йод не образуют с ним прочного соединения, и образующиеся комплексы легко вымываются из клетки спиртом. Такие бактерии обесцвечиваются спиртом и дополнительно докрашиваются фуксином, приобретая розовый цвет. К грамотрицательным бактериям относятся кишечная палочка, сальмонеллы, бруцеллы.

Рисунок 2.3. Схема строения грамм-положительных и грамм –отрицательных бактерий

 

Задание 2:Зарисовать в рабочей тетради схемы грамм-положительных и грамм –отрицательных бактерий и освоить технику окраски бактерий по Граму.

Таким образом, различное отношение бактерий к окраске по Граму зависит от количества муреина и его локализации в клеточной стенке.\Техника окраски по Граму

1. Подготовить и зафиксировать мазок из смеси кишечной палочки и дрожжей.

2.На фиксированный мазок нанести полоску фильтровальной бумаги, пропитанной генцианвиолетом, и накапать на неё 3-5 капель воды, выдержать 2 мин.

3.Бумагу удалить обратным концом спички или пинцетом, препарат промыть по ребру стекла водой и залить раствором Люголя на 2 мин.

4. Промыть препарат водой.

5.Нанести спирт на препарат не более чем на 30 с - 1 мин. Время обесцвечивания мазка соблюдать особенно тщательно. Передержка и недодержка спирта на препарате приведет к искажению результатов.

6. Промыть препарат водой.

7.На мазок нанести полоску фильтровальной бумаги, пропитанной фуксином Пфейфера, и накапать на неё 3-5 капель воды. Выдержать 2 мин.

8.Бумажку убрать, фуксин хорошо смыть водой.

9.Мазок высушить между листами фильтровальной бумаги.

10.Провести микроскопию препарата с применением иммерсии. «Г+» бактерии окрасятся в фиолетовый цвет, «Г-» бактерии - в красный.

Чтобы получить правильную окску по Граму, рекомендуется употреблять для окраски суточные культуры микробов.

Микроскопирование бактериальных препаратов. Изучение микроорганизмов в живом состоянии. Препараты, приготовленные из живых микробов, используются для определения формы клеток, наблюдения за подвижностью микробов, их размножением, спорообразованием, хемотаксисом. Для этого готовят препараты “раздавленная капля” и “висячая капля”.

Таблица 1. Окраска фиксированного мазка-препарата по Граму

Фаза	Краски, реактивы	Время действия	Процесс
	Генцианвиолет (смывают водой)	2 мин	Окрашиваются все бактерии (грамположительные и грамотрицательные)
	Раствор Люголя (стряхивают, можно промыть водой)	2 мин	Образуется комплекс: нерастворимый у грамположительных и труднорастворимый у грамотрицательных
	Спирт 960 (смывают водой)	30 с	Обесцвечиваются грамотрицательные бактерии
	Фуксин (смывают водой)	1 мин	Окрашиваются грамотрицательные бактерии

Примечание: Препарат высушивают между листами фильтровальной бумаги и рассматривают с иммерсией в микроскоп.

Таблица 2. Окраска спор по Пешкову

Фаза	Краски, реактивы	Время действия	Процесс
	Метиленовая синь	Кипятят 15-20 с над пламенем спиртовки	Окрашиваются споры и цитоплазма клетки
	Смывают водой		Цитоплазма обесцвечивается
	Нейтральрот 0,5%-й (смывают водой)	30 с	Цитоплазма окрашивается

Примечание. Мазок высушивают между листами фильтровальной бумаги и исследуют под микроскопом. После окраски споры приобретают голубую или синюю окраску, а цитоплазма клетки становится розовой.

Раздавленная капля. На середину чистого обезжиренного предметного стекла петлей или стерильной пипеткой наносят маленькую каплю взвеси микробов в физрастворе (если препарат готовят из культуры, взятой с плотной питательной среды) или бульонной культуры. Рядом с каплей на ребро ставят чистое покровное стекло и постепенно опускают его на каплю. В правильно сделанной капле под покровным стеклом не должно быть пузырьков воздуха, мешающих микроскопированию. Удачно сделанная капля должна заполнять все пространство между предметным и покровным стеклами, но не выходить за края последнего. Если же капля выходит за пределы покровного стекла, фильтровальной бумагой снимают лишнюю влагу и эту бумагу опускают в дезраствор. Препарат исследуют суховоздушными объективами наибольшего увеличения (40´, 60´) в затемненном поле зрения, т.е. при опущенном конденсоре и суженной диафрагме. Бактерии, имеющие жгутики, активно движутся, проплывая через все поле зрения. Монотрихи с одним жгутиком движутся в одном направлении, перитрихи совершают вращательные или круговые движения. Бактерии бeз жгутиков совершают беспорядочное колебательное движение, обусловленное броуновским движением.

Висячая капля. Препарат изготовляют из бульонной культуры или водной взвеси микробов. При этом суспензия микроорганизмов не должна быть густой. Обезжиренные предметное стекло с луночкой и покровное стекло фламбируют в пламени спиртовки. Вокруг лунки по краям наносят тонкий слой вазелина. В центре покровного стекла помещают петлей или микропипеткой (пастеркой) небольшую каплю культуры. Предметное стекло держат лункой вниз и, плотно прижимая к покровному стеклу, так, чтобы капля находилась в середине лунки, быстро (но осторожно) переворачивают. Капля должна свободно свисать, но не соприкасаться с дном и краями лунки. Покровное стекло при этом вазелином склеивается с предметным и создается влажная, герметически закрытая камера, где капля долго не высыхает, что обеспечивает возможность длительного наблюдения.

Если капля растеклась по выемке и вышла за её края, то препарат готовят заново. Препарат рассматривают под малым увеличением микроскопа в затемненном поле зрения при суженной диафрагме и опущенном конденсоре. Найдя край капли и уточнив фокус, можно рассматривать препарат через объективы 40´, 60´ и окуляр 15.