Здавалка
Главная | Обратная связь

Глава 8. БАКТЕРИОФАГИ



Бактериофаг - ультрамикроскопический, внутриклеточный паразит - вирус, лизирующий бактерии и актиномицеты.
Впервые явление бактериофагии наблюдал в 1898 г. Н.Ф. Гамалея, позднее - Туорт в 1915 г. и Эррелль в 1917 г.

 

Бактериофаг обладает всеми основными свойствами, присущими вирусам, а именно:
1) имеет элементарные частицы величиною в пределах от 20 до 200 нм;
2) содержит в своем составе нуклеиновую кислоту и белок;
3) не растет на искусственных питательных средах, размножаясь только внутри клеток микробов;
4) обладает высокой специфичностью в отношении поражаемой клетки;
5) имеет антигенную обособленность от клетки хозяина.

 

Бактериофагу присуща наследственность, изменчивость, приспособляемость и другие свойства вирусов. Корпускулы бактериофагов имеют форму сперматозоидов или головастиков и состоят из сферической, цилиндрической или многогранной головки и короткого или длинного прямого или изогнутого отростка.
Фаговая частица состоит из белковой оболочки и внутреннего содержимого, в основном представляющего собой фибриллы дезоксирибонуклеиновой кислоты. В отростке фаговой корпускулы имеется центрально расположенный стерженек белковой природы. На конце отросток имеет утолщение в виде пластинки, от которого отходят белковые нити диаметром не более 2 миллимикронов.
В настоящее время описаны бактериофаги различных аэробных и анаэробных патогенных и сапрофитных бактерий (кокков, палочек, вибрионов, бацилл, микобактерий) и актиномицетов.

 

Бактериофаг вступает в определенное взаимодействие с микробной клеткой. Это взаимодействие, называемое литическим циклом, включает следующие этапы:
1) адсорбция фаговых частиц на поверхности бактерий;
2) внедрение активного фагового материала внутрь клетки;
3) внутриклеточное размножение бактериофага;
4) разрыв клеточной оболочки и выход новообразованного бактериофага во внешнюю среду.

Распространение бактериофага
Бактериофаги широко распространены в природе. Почти везде, где условия обитания благоприятны для размножения бактерий и актиномицетов, удается обнаружить паразитирующие в их клетках бактериофаги. Их можно выделить из открытых полостей организма человека и животных, различных водоемов, сточных вод, из влажной, унавоженной почвы, из соответствующих культур бактерий и актиномицетов. Много бактериофагов находится в выделениях больных людей и животных, особенно в период выздоровления от инфекционных заболеваний. Так, бактериофаги против возбудителей брюшного тифа, паратифов А и Б, дизентерии, холеры можно выделить из испражнений, против гноеродных кокков - из гнойного отделяемого ран и воспалительных очагов, против туберкулезной палочки - из мокроты и т.д.
Большую роль в распространении и сохранении бактериофагов в природе играют так называемые лизогенные бактерии и актиномицеты, постоянно выделяющие бактериофаги во внешнюю среду.

 

Для выделения бактериофага исследуемый материал (воду, испражнения, гноя, почву и др.) засевают в жидкую питательную среду, наиболее благоприятную для развития тех микроорганизмов, против которых ищут бактериофаг. Среду оставляют в термостате на 18-20 часов. Иногда производят предварительное обогащение среды чистой культурой соответствующего микроба, заведомо нелизогенного, т.е. не выделяющего бактериофаг. Помутневшую питательную среду пропускают через бумажный, а затем через бактериальный фильтр, асбестовые пластины, керамические свечи. Полученный фильтрат испытывают на присутствие бактериофага путем засева совместно с соответствующей микробной культурой на плотные (методом стекающей капли - проба Отто) или жидкие питательные среды. При наличии бактериофага после 18-часовой инкубации на поверхности агара, обнаруживается сплошной налет культуры, а па месте растекающейся, капли, в зависимости от содержания частиц бактериофага в фильтрате, бактериальный рост полностью отсутствует или наблюдаются округлые «стерильные пятна» - колонии бактериофага. На жидкой питательной среде присутствие бактериофага обусловливает просветление
культуры.

 

Для выделения чистой культуры бактериофага материал из развившегося отдельного стерильного пятна переносят бактериологической иглой в суспензию молодой микробной культуры.
Для гарантии чистоты бактериофага операцию выделения из изолированного стерильного пятна последовательно повторяют 5-10 раз. Материал из последнего стерильного пятна снова засевают вместе с фагочувствительными микробами на жидкую питательную среду. После 6-18-часовой инкубации культуру фильтруют, проделывают несколько пассажей для увеличения количества бактериофаговых корпускул и получают чистую культуру бактериофага.
Выделенный из внешней среды, бактериофаг, культивируемый в лабораторных условиях на соответствующей культуре бактерий, называется маточным штаммом соответствующего бактериофага.

Практическое значение бактериофага
В настоящее время выпускаются и применяются следующие виды бактериофагов: коли жидкий, коли-протейный жидкий и протейный жидкий бактериофаги, бактериофаг брюшнотифозный поливалентный (жидкий и сухой), диагностический брюшнотифозный бактериофаг, дизентерийный поливалентный лечебный (сухой) и диагностический бактериофаг, холерный бактериофаг, стафилококковые антифагин и диагностические типовые бактериофаги и стрептококковый жидкий бактериофаг
Бактериофаг широко применяется для диагностики, профилактики и лечения ряда инфекционных заболеваний бактериальной этиологии - дизентерии, брюшного тифа, холеры, чумы, геморрагической септицемии, стафилококковых, стрептококковых и анаэробных инфекций и др. В связи с его высокой специфичностью он применяется также как диагностический препарат для идентификации бактериальных культур в медицинской, ветеринарной, технической микробиологии и фитопатологии.

 

Метод фаготипажа, основанный на исключительной специфичности определенных штаммов бактериофага, позволил распределить на фаготипы ряд штаммов бактерий, которые неотличимы друг от друга по другим признакам. Фаготипаж с успехом применяется при идентификации бактерий брюшного тифа, сальмонелл, стафилококков и ряда других бактерий. Этот метод дает возможность эпидемиологу точно проследить за цепочкой заразных заболеваний и определить источник инфекции (бациллоноситель, больной). Известное диагностическое значение для клиники имеет выделение бактериофага из испражнений больного при некоторых кишечных инфекциях, в особенности при дизентерии.

 

Важное значение имеет бактериофаг для быстрого обнаружения очень небольших количеств патогенных бактерий во внешней среде путем определения нарастания титра специфического бактериофага.
Бактериофаг применяется и для борьбы с бактериальными вредителями различных технических брожений и в производстве ферментов, продуцируемых бактериальными культурами. В то же время бактериофаг, заражая культуры микробов, является опасным вредителем денных производственных штаммов микроорганизмов (вакцинных, возбудителей молочнокислого, ацетонобутилового и некоторых других брожений, продуцентов антибиотиков), вызывая серьезные нарушения технологического процесса.

 

Бактериофаг - один из наиболее мощных факторов изменчивости бактерий и актиномицетов. Он играет определенную роль в самоочищении воды и почвы.

Технология производства и контроль бактериофагов
В производственных условиях для изготовления препарата бактериофага применяются только апробированные штаммы бактериофагов и культуры соответствующих микробов, обладающих типичными морфологическими, биохимическими и серологическими свойствами. Штаммы бактериофагов должны быть музейными и рабочими. На производстве они часто называются маточными бактериофагами. Музейные производственные штаммы бактериофагов ежегодно обновляются путем выделения новых или пассажами имеющихся штаммов бактериофага через организм больного, а также адаптацией к свежевыделенным, резистентным к данному бактериофагу культурам. Маточный бактериофаг должен размножаться и пассироваться только на соответствующей культуре в жидкой питательной среде, например, брюшнотифозный бактериофаг пассируется на культуре брюшнотифозной палочки в бульоне Мартена.

 

Рабочий маточный бактериофаг готовится из очередной серии музейного штамма бактериофага, отдельно на каждом из производственных штаммов микробов.
Препарат бактериофага представляет собой фильтрат бульонной культуры соответствующих микробов, лизированных фагом. Он содержит большое количество размножившихся фагов, обладающих специфическими лизирующими свойствами.

 

Получение бактериофага в настоящее время осуществляется в специальных аппаратах - реакторах, емкостью от 250 до 1000 л, с применением аэрации как фактора, стимулирующего развитие микроорганизмов. Для производства бактериофага берется его рабочая маточная раса и соответствующие культуры микробов. В реактор наливается жидкая питательная среда, например, бульон Мартена или Хоттингера для изготовления брюшнотифозного и дизентерийного бактериофагов с рН 7,4-7,6 и стерилизуется при температуре 110 °С в течение 40 минут. После стерилизации среда охлаждается до 39 °С и засеивается соответствующей микробной культурой и маточным бактериофагом одновременно. Для засева употребляются 18-часовые агаровые культуры, которые прибавляются из расчета 50 млн. микробных тел на 1 мл среды. Бактериофаг добавляется в количестве не более 0,3 % по отношению к объему питательной среды. Среду с засеянными в ней культурой и бактериофагом оставляют при температуре 37 °С на 6-18 часов. Бактериофаги активно размножаются внутри бактериальных клеток, увеличиваясь в количестве и вызывая их лизис, что внешне проявляется полным просветлением среды. К полученному лизату добавляется в качестве консерванта хинозол (0,01 %) или фенол (0,25 %) и не позже чем через 2 часа после этого содержимое реактора фильтруется через бактериальные фильтры (асбестовые пластины, свечи Шамбеолена или свечи ГИКИ соответствующей пористости) для удаления оставшихся микробных клеток.
Полученный препарат-бактериофаг должен иметь вид, совершенно прозрачной жидкости желтого цвета большей или меньшей интенсивности. Он проходит контроль на стерильность, безвредность и литическую активность, т.е. вирулентность.

 

Стерильность бактериофага проверяют обычным способом.
Безвредность препарата проверяют путем введения животным, например, брюшнотифозный и дизентерийный бактериофаги вводят подкожно трем мышам по 1 мл, либо внутривенно одному кролику 5 мл. Наблюдение за животными ведется в течение 3-4 суток; если препарат безвреден, они должны оставаться бодрыми и здоровыми.
Литическая активность бактериофага, его вирулентность определяются методом титрования на жидкой и плотной питательной среде.
Определение вирулентности методом Аппельмана проводится по следующей схеме: набирается ряд пробирок, содержащих по 4,5 мл мясо-пептонного бульона; в первую из них добавляется бактериофаг в количестве 0,5 мл, тщательно перемешивается другой пипеткой и в количестве 0,5 мл переносится в следующую пробирку, из второй - 0,5 мл в третью и т.д. В серии пробирок бактериофаг разводится 1:10; 1:100; 1:1000 и т.д. Во все пробирки, включая и контрольную, содержащую только 4,5 мл бульона, вносят по 250 млн микробных тел суточной культуры соответствующих бактерий, затем ставят их на 18-20 часов в термостат, после чего учитывают результат. Степень лизиса отмечается плюсами следующим образом: четыре плюса (++++) - абсолютная прозрачность среды, равная стерильному бульону; три плюса (+++) - почти полная прозрачность, лишь незначительно отличающаяся от стерильного бульона; два плюса (++) - муть, значительная по сравнению со стерильным бульоном, но незначительная по сравнению с контрольной пробиркой; один плюс (+) - явная муть, но все же более слабая, чем в контрольной пробирке, минус (-) - муть, как в контрольной пробирке.
Определение вирулентности на плотной питательной среде методом Отто заключается в следующем: на определенные сегменты агаровых пластинок в бактериологических чашках, хорошо подсушенных в термостате и предварительно засеянных сплошным газоном соответствующей культуры, наносится по одной капле исследуемого бактериофага определенного разведения, соответствующего разведению в аппельмановском ряду. Капли подсушиваются и чашки помещаются в термостат на 18-20 часов. Результат учитывается по степени лизиса и обозначается плюсами: четыре плюса (++++) - полный лизис; на месте закапывания бактериофага культура не растет; три плюса (+++) - лизис с наличием единичных колоний культуры; два плюса (++) - лизис в виде сливных участков с островками роста культуры; один плюс (+) - лизис в виде отдельных стерильных пятен на сплошном газоне культуры; минус (-) - сплошной рост культуры, не обнаруживается ни одного стерильного пятна.
За титр бактериофага при определении методом Аппельмана принимают то наибольшее разведение его, которое вызывает полное растворение соответствующих микробов. Бактериофаги выпускают, с определенными титрами, не ниже установленных, по инструкции. Так, титр брюшнотифозного бактериофага со всеми штаммами, входящими в титрование, должен быть не ниже 10-7 для штаммов, находящихся в Vi-форме, и не ниже 10-6 для штаммов, находящихся в 0-форме.
После проведения контролей бактериофаг разливается во флаконы нейтрального стекла (по 25, 50 и 100 мл), которые должны быть укупорены резиновой пробкой соответствующего размера и залиты смолкой.
Условия хранения бактериофага такие же, как и других препаратов.
Срок годности брюшнотифозного, холерного; гангренозного, стафилококкового и стрептококкового бактериофагов - один год, а дизентерийного - два года.
Помимо жидких препаратов бактериофага могут изготавливаться также сухие. Для получения их, действующее начало жидкого фаголизата осаждается сернокислым аммонием. Выпавший осадок отделяется от жидкой части, к сырой массе добавляется в качестве стабилизатора глюконат кальция (9 %), смесь тщательно растирается, замораживается при - 30 °С и высушивается под вакуумом.

 

Выпускается сухой фаг в виде таблеток, которые содержат стабилизированную субстанцию фаголизата, обычно применяемую таблеточную смесь (глюкозу, глюконат кальция, тальк, стеарин) и покрыты защитной кислотоустойчивой оболочкой из ацетилцеллюлозы. Одна таблетка cyxогo бактериофага соответствует 20-25 мл жидкого.
В отношении стерильности и безвредности к сухим бактериофагам предъявляются те же требования, что и к жидким. Титр сухих бактериофагов устанавливается в соответствии с их лизирующей активностью, по отношению к разным видам и типам микробов.
Применяются они в тех же случаях, что и жидкие бактериофаги. Срок годности сухих фагов - 1 год.

Глава 9. ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ ДИАГНОСТИКУМЫ И АНТИГЕНЫ

Диагностические препараты применяются для следующих целей:
1) для определения с помощью специфических иммунных сывороток вида или типа микроба выделенного от больного, носителя или из объектов внешней среды;
2) для обнаружения с помощью диагностикумов антител в сыворотке больных или реконвалесцентов;
3) для выявления с помощью аллергенов перестройки организма, возникающей при некоторых инфекционных заболеваниях.

 

Все диагностические препараты представляют собой антигены или антитела.
Общие сведения о диагностикумах
Диагностикумы - это взвеси убитых микробов, чаще всего в физиологическом растворе, применяемые в качестве антигенов для серологических реакций.
Преимущество диагностикумов перед живой культурой заключается в стабильности их агглютинабильных свойств, стандартности, безопасности и простоте обращения с ними. Использование диагностикумов дает возможность широко применять серологические методы в практике массовой работы. Особое значение имеют диагностикумы в случаях, когда работа с живыми бактериями или вирусами опасна из-за их высокой инфекционности (например, с бруцеллами, туляремийными бактериями, вирусами клещевого и японского энцефалитов и др.).
Диагностикумы, используемые для распознавания инфекционных заболеваний, делятся на бактерийные, риккетсиозные и вирусные. С их помощью в сыворотке больных можно определить наличие антител по отношению к определенному виду микроба-возбудителя.

 

Более тонкие различия антител в изучаемой сыворотке устанавливают при помощи специфических монодиагностикумов. Так, при брюшном тифе для определения групповых О-антител и видовых Н-антител применяются соответствующие О- и Н-диагностикумы из культуры брюшнотифозных бактерий 0-901 или бактерий паратифа № 2, обладающих общим О-антигеном с брюшнотифозными бактериями; Н-диагностикум представляет собой взвесь бактерий, обладающих выраженной подвижностью.

Бактерийные диагностикумы
Для приготовления бактерийных диагностикумов берется агаровая суточная культура определенного вида микроба, находящегося в S-форме.
Культуры должны агглютинироваться соответствующими эталонными сыворотками в разведении до титра, определяемого реакцией агглютинации на три креста, а также быть типичными по морфологическим и биохимическим свойствам. Агглютинация с гетерологичными сыворотками в разведении выше 1/8 титра не должна иметь места.
Производство диагностикумов, как и всех биологических препаратов, требует стерильных условий.
Проверенные 18-20 часовые агаровые культуры или 4 часовые бульонные засевают на матрацы с агаром, приготовленным на мясном, дрожжевом или казеиновом гидролизате. Через 18-20 часов инкубации в термостате при 37 °С из культур делают мазки (с каждого матраца отдельно) для проверки чистоты. Затем культуру смывают физиологическим раствором и полученную взвесь разных штаммов одного вида микробов сливают в одну градуированную бутыль. При массовом производстве применяется котловой метод выращивания бактерий. Диагностикумы готовят из разных количеств штаммов соответствующих микробов.

 

Густоту маточной взвеси определяют по оптическому стандарту. Допускается получение маточной взвеси, содержащей в 1 мл 10 млрд. микробных тел. Далее маточная взвесь инактивируется. Инактивацию можно проводить различными способами: прогреванием, действием формалина, алкоголя и др. Так, для определения фагоцитарной активности лейкоцитов диагностикумы готовят из микробов, убитых нагреванием, так как фенол или формалин обусловливают отрицательный хемотаксис лейкоцитов.

 

При изготовлении формалинизированных диагностикумов к 10-миллиардной взвеси добавляют разные количества формалина в зависимости от вида диагностикума. После прибавления формалина бутыль закрывают резиновой пробкой, тщательно встряхивают и помещают в термостат при 37 °С на 18-20 часов или оставляют на 2 суток при комнатной температуре. По истечении этого срока производят посев для определения стерильности, после чего проверяют агглютинабильность маточной взвеси с гомологичными сыворотками. Маточную взвесь разводят формализированным 0,1 % физиологическим раствором до густоты в 3 млрд. по оптическому стандарту. После разведения диагностикума снова производят контроль на стерильность.

 

Для изготовления спиртового диагностикума суточная культура О-штамма смывается с матрацев физиологическим раствором, содержащим 0,5 % карболовой кислоты. Маточная взвесь разводится до густоты 4-х млрд. в 1 мл. Для разведения применяется смесь карболизированного физиологического раствора с 96 % этиловым спиртом, взятым в соотношении 1:2. Спирт предварительно фильтруется через бактериальный фильтр. Содержимое бутылей тщательно перемешивается. Диагностикум помещается на 48 часов в термостат при 37 °С и затем оставляется на трое суток при комнатной температуре. Спиртовые диагностикумы также контролируются на стерильность.

 

Готовый диагностикум проверяют на агглютинабильность гомологичной агглютинирующей сывороткой и для выявления групповых агглютининов - гетерологичными сыворотками. Кроме того, диагностикум испытывают в реакции агглютинации с сыворотками здоровых людей (5 сывороток). Реакцию агглютинации с диагностикумами ставят по классической методике.
Готовые диагностикумы разливают в ампулы по 5 или 10 мл; они, как правило, содержат 3 млрд. микробных тел в 1 мл за исключением туляремийного, содержащего 50 млрд. бактерий в 1 мл, и бруцеллезного диагностикума, содержащего 20 млрд. микробных тел в 1 мл. После контроля производят этикетировку препарата. Диагностикумы годны в течение года с момента разведения маточной взвеси.

 

Формалинизированные Н-диагностикумы дают крупнохлопчатую Н-агглютинацию, при которой хлопья легко разбиваются, в связи с чем при чтении реакции следует избегать сильного встряхивания пробирок. О-диагностикумы дают мелкозернистую агглютинацию, не разбивающуюся при встряхивании.
Используется также Vi-диагностикум, позволяющий обнаружить Vi-антитела в сыворотках больных брюшным тифом и бактерионосителей.
Он представляет собой взвесь брюшнотифозных палочек, обезвреженных формалином (0,4 %). Для получения препарата рекомендуются штаммы в V-форме, типичные по всем признакам и не имеющие жгутикового аппарата. Диагностикум содержит 3 млрд. микробных тел в 1 мл взвеси. Специфическая активность его проверяется в реакции агглютинации с эталонной монорецепторной Vi-сывороткой. Срок годности 1 год.

 

В ряде случаев для целей серологической диагностики применяют не корпускулярные диагностикумы, а выделенные из микробных тел антигены.
Микробная клетка представляет собой сложный глюцидо-липоидно-полипептидный комплекс, в который входят как полноценные антигены, так и гаптены. Изготовление полных антигенов проводится по способу Буавена и Мезробеану. Для этой цели берут хорошо изученную чистую культуру определенного вида микробов и производят посев на питательные среды. Через сутки инкубации при 37 °С смыв культуры дважды промывают (при центрифугировании), физиологическим раствором, затем экстрагируют при низкой температуре десятикратным количеством 1/4 N раствора трихлоруксусной кислоты. Экстракт нейтрализуют углекислой содой до рН 7,0 и диализуют в течение 2 суток в текучей водопроводной воде и в течение 1 суток - в дистиллированной воде. Диализованный экстракт осаждают четырьмя объемами ацетона, растворяют в дистиллированной воде и вторично осаждают ацетоном. Полученный осадок полного антигена промывают спиртом и эфиром, высушивают и хранят в виде сухого порошка.

 

Антигены из микробных клеток извлекают и другими способами: многократным замораживанием с последующим оттаиванием, кипячением, действием ультразвука, спирта, соляной кислоты и др.
Бактерийные антигены применяются в реакциях преципитации, пассивной гемагглютинации с диагностическими целями и для изучения антигенного аппарата микробов и их типизации.

 

В настоящее время разработаны методы приготовления эритроцитарных диагностикумов с длительным сроком годности. Действующим началом их являются извлеченные из тех или иных микроорганизмов антигены, которыми сенсибилизированы эритроциты.

 

Принцип приготовления эритроцитарных диагностикумов сводится к следующему: дефибринированная кровь человека О (1) группы или барана фильтруется через марлю и трижды отмывается на центрифуге охлажденным физиологическим раствором. После этого производится обработка эритроцитов формалином. Готовят взвесь, содержащую 12,5 % эритроцитов, в нее помещают целофановый мешок с формалином и встряхивают на шюттель-аппарате в течение 16 часов. В первые 2 часа формалин поступает через поры целофана, затем его прокалывают и, наконец, разрывают. Этот прием позволяет получить медленное вначале и постепенно усиливающееся действие формалина на эритроциты. По окончании срока встряхивания эритроциты вновь фильтруют через марлю, отмывают 6 раз десятикратным объемом охлажденного до 4-5 °С физиологического раствора на центрифуге при 2500-3000 об/мин, соединяют с равным объемом стерильного нейтрального физиологического раствора и разливают во флаконы. В таком виде формалинизированные эритроциты можно хранить до года. В дальнейшем, в зависимости от характера антигена, эти эритроциты либо обрабатывают дополнительно таннином, либо соединяют с антигеном без этой обработки.

 

Так, для приготовления дифтерийного и столбнячного эритроцитарных диагностикумов, формалинизированные эритроциты отмывают один раз физиологическим раствором (рН 7,2), разводят их до 2,5 % концентрации, добавляют равный объем таннина в разведении 1:20000, взбалтывают и выдерживают 15 минут при комнатной температуре. Затем эритроциты отмывают 3 раза пятью-шестью объемами физиологического раствора (рН 7,2). Проверяют на отсутствие спонтанной агглютинации, готовят 2,5 % взвесь, к которой прибавляют очищенные, концентрированные анатоксины - дифтерийный (10-20 Lf на один миллилитр взвеси) или столбнячный (5-10 ЕС на один миллилитр взвеси).
Смесь выдерживают при 37 °С - 3 часа. За один час до окончания инкубации добавляют 1 % формалина, встряхивают жидкость до образования равномерной взвеси. После этого срока эритроциты снова отмывают три раза нейтральным физиологическим раствором, содержащим 1 % формалина. Отмытые сенсибилизированные эритроциты разводят фосфатно-буферным раствором (рН 7,0) с формалином (1 %) так, чтобы в 0,05 мл взвеси содержалось 6-8 млн. эритроцитов (подсчет в камере Горяева). В препарате проверяют густоту взвеси, отсутствие спонтанной агглютинации, специфическую активность с соответствующими иммунными сыворотками. Для контроля применяют эритроциты, обработанные таким же способом только не сенсибилизированные антигеном.
Срок годности столбнячного и дифтерийного эритроцитарных диагностикумов - 6 месяцев.

 

При изготовлении туляремийного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты сенсибилизируют антигеном, полученным по методу Буавена и Мезробеану из высушенных туляремийных бактерий.
Для постановки реакции употребляют 2,5 % взвесь сенсибилизированных эритроцитов. Активность препарата проверяют в реакции непрямой гемагтлютинация с агглютинирующей противотуляремийной сывороткой. Если сенсибилизированные эритроциты агглютинируются этой сывороткой в разведении ее меньшем, чем предусмотрено инструкцией - эритроцитарный диагностикум бракуется.
Срок годности препарата - 9 месяцев.

 

Эритроцитарный Ви-диагностикум представляет собой формалинизированные эритроциты человека 0 (1) группы, сенсибилизированные очищенным Ви-антигеном брюшнотифозных бактерий, в фосфатно-буферном физиологическом растворе. Препарат стандартизируют таким образом, чтобы 1 мл взвеси содержал 50 млн. эритроцитов. Специфическая активность эритроцитарного Ви-диагностикума определяется в РНГА с одной адсорбированной брюшнотифозной Ви-сывороткой и пятью сыворотками людей, привитых против брюшного гифа. Препарат годен в течение шести месяцев.

Риккетсиозные диагностикумы
Для дифференциальной диагностики риккетсиозов серологическим методом в постановке реакций связывания комплемента и агглютинации широко применяются цельные риккетсиозные антигены. Для приготовления диагностикумов из риккетсий могут быть использованы куриные эмбрионы, белые мыши, платяные вши.
Для заражения куриных эмбрионов используются штаммы риккетсий Провачека, Музера и Бернета.
Риккетсии культивируют в желточном мешке эмбриона. После размножения риккетсий желточные мешки, извлеченные стерильными пинцетами из вскрытых яиц, помещают в стерильные банки со стеклянными бусами (5-10 желточных мешков в банку) и измельчают путем тщательного встряхивания. К полученной массе добавляется физиологический раствор из расчета 10 мл на 1 желточный мешок. Все вновь тщательно встряхивается для лучшего измельчения тканей, и затем, в каждую банку добавляется еще 100 мл физиологического раствора, содержащего формалин в количестве от 0,8 (для культур риккетсий Провачека и Музера) до 1 % (для риккетсий Бернета) и 10 % фосфатного буфера с рН 7,0. После встряхивания банки помещаются в рефрижератор и хранятся там до истечения срока обезвреживания.
В дальнейшем полученная указанным способом первичная взвесь риккетсиозного материала сводится в бутыли соответствующей емкости (по 100 желточных мешков).
Дальнейшая обработка первичной взвеси риккетсий Провачека и Музера производится не ранее 48 часов пребывания риккетсиозного материала в формалинизированном физиологическом растворе, а риккетсий Бернета только после 15 дней пребывания в этих же условиях.
Обработка первичной взвеси производится методом сепарирования или центрифугирования в комбинации с эфирной обработкой. Осадок после третьего сепарирования состоит обычно из чистых риккетсий. Сепарированием и эфирной обработкой достигается отделение риккетсий от тканевых примесей.
Риккетсиозная взвесь стандартизуется по оптическому бактерийному стандарту и доводится путем разведения стерильным физиологическим раствором с 5 % сахарозы до концентрации, соответствующей мутности 2 млрд. микробных тел в 1 мл. Стандартизованная взвесь разливается в ампулы по 0,5 мл, замораживается при t -20... -25°С и высушивается в вакууме. Риккетсиозный антиген подвергается контролю на растворимость, правильность стандарта, ставятся реакции агглютинации и связывания комплемента с типовой иммунной сывороткой, проводится микроскопический контроль на отсутствие бактериального загрязнения. Сухой антиген хранится при температуре +4... +10°С. Он годен в течение 2,5 лет.

 

Для серологической диагностики некоторых риккетсиозов, например, исторического сыпного тифа, применяется антиген из риккетсий, культивированных в кишечниках вшей.
Для изготовления антигена используется несколько штаммов риккетсий Провачека, выделенных от больных сыпным тифом. Этими штаммами заражают с помощью микроклизмы взрослых, здоровых платяных вшей. До момента гибели их кормят один раз в день на донорах, перенесших сыпной тиф или привитых.
Зараженные вши погибают в сроки от четвертого до восьмого дня. После гибели их помещают в 0,5 % фенол, через 2-3 дня вскрывают, отсепарировают кишечники, растирают их в ступке с физиологическим раствором, содержащим 0,5 % фенола, затем взвесь центрифугируется или оставляется для осаждения крупных частиц.

 

Антиген представляет собой взвесь в физиологическом растворе убитых фенолом риккетсий Провачека, культивированных в кишечниках зараженных вшей. Он содержит в 1 мл 3-5 млрд. риккетсий (50-60 кишечников зараженных вшей).
Для предупреждения порчи от замерзания во время транспортировки в некоторые серии добавляют 10 % глицерина; это не отражается на специфической активности препарата, но делает его более морозоустойчивым. Готовый антиген проверяют на агглютинабильность сыворотками сыпнотифозных больных или типовыми иммунными сыворотками и сыворотками здоровых людей. Готовый антиген испытывается на специфическую стерильность путем внутрибрюшинного введения 2 мл взвеси осадка антигена морским свинкам или вшам по методу Вейгля. У свинок ежедневно измеряют температуру. Если у них не отмечается повышения температуры, антиген считается специфически стерильным. При заражении вшей микроскопическое исследование мазков из кишечников проводится с 6-го по 10-й день, в мазках не должны обнаруживаться риккетсии.
Готовый диагностикум разливается в ампулы по 1,5 или 10 мл. Срок годности равен 1 году. Препарат проходит контроль на стерильность, соответствие стандарту и агглютинабильность.
Применяется в реакции макроагглютинации. Характер агглютинации риккетсий мелкозернистый. Реакция высокоспецифична. Положительный результат 1:40 + + + + считается диагностическим титром.
В разведенном виде препарат можно применять для реакции связывания комплемента.

 

Помимо вышеперечисленных антигенов для диагностики эпидемического сыпного тифа и крысиного риккетсиоза применяется антиген, приготовленный из легких белых мышей, зараженных риккетсиями Провачека и Музера.
Богатые риккетсиями мышиные легкие размельчаются в ступке с кварцевым песком и разводятся формалинизированным физиологическим раствором из расчета 3-4 мл на легкое.
Далее формалинизированная взвесь центрифугируется дважды: один раз при 1500 оборотах в минуту для удаления тканевых примесей, другой раз при 3000 оборотах в минуту для получения риккетсий в осадке. Осадок обрабатывается физиологическим раствором, содержащим 0,4 % формалина и 0,5 % фенола.
В дальнейшем он подвергается обработке эфиром, после чего к нему добавляется сахароза и производится высушивание из замороженного состояния в условиях глубокого вакуума.

 

Готовый препарат представляет собой сухой антиген из хорошо очищенных убитых формалином риккетсий, подвергнутый контролю по вышеописанной методике.

Вирусные диагностикумы - антигены
Вирусные диагностикумы представляют собой антигены, используемые для серологических реакций. В зависимости от цели применения их подразделяют на антигены для реакции связывания комплемента и антигены для реакции торможения гемагглютинации.
Для изготовления диагностикумов из разных вирусов используются преимущественно следующие инфицированные материалы: для вируса гриппа - аллантоисная жидкость, для эпидемического паротита - амниотическая или аллантоисная жидкость, для орнитозов и лимфогранулемы - желточные мешки куриных эмбрионов, для вирусов энцефалитов - мозговая ткань мышей, куриных эмбрионов или культура тканей, для аденовирусов и полиомиелита - культуральные жидкости. Диагностикумы из аллантоисной и амниотической жидкости употребляют в нативном виде, другие - требуют специальной сложной обработки, так как обладают антикомплементарными свойствами.
Методы обработки антигенов делятся на физические и физико-химические. Из физических методов наибольшее применение имеет метод повторного замораживания и оттаивания, т.е. термолизис. Из физико-химических методов - обработка эфиром и хлороформом.

 

Метод термолизиса заключается в следующем: готовится 10 % суспензия на физиологическом растворе из инфицированной ткани, куда добавляется 2 % инактивированной сыворотки морской свинки. После 18-20 часового экстрагирования при 4 °С крупные тканевые частицы удаляют путем центрифугирования в течение 30 минут при 2500 оборотах. Надосадочная жидкость подвергается пятикратному замораживанию (при -7 °С) и оттаиванию (при +7 °С). Затем жидкость центрифугируют в течение часа при 3500 оборотах в минуту. Приготовленный таким образом диагностикум представляет собой слегка опалесцирующую жидкость.

 

Обработка вирусных диагностикумов физико-химическим методом заключается в том, что готовят суспензию, как описано выше для термолизиса, к ней добавляют полуторный объем эфира или хлороформа и в течение 2 часов производят встряхивание. Материал помещают на 18 часов в холодильник при 4 °С. Затем центрифугируют в течение 30 минут при 3000 оборотах в минуту. Происходит расслоение суспензии. В случае обработки эфиром антиген будет в нижнем слое, а при обработке хлороформом - в верхнем. Готовый антиген по внешнему виду представляет прозрачную жидкость. Вирусные диагностикумы не должны содержать живых вирусов. Инактивирование их производится либо прогреванием (37 °С), либо действием химических веществ (формалин, бетапропиолактон).
Существует значительное количество модификаций приготовления антигенов применительно к тому или иному вирусу. Выпускаются вирусные, антигены для диагностики следующих заболеваний: японского и клещевого энцефалита, лимфоцитарного хориоменингита, орнитозов, гриппа и эпидемического паротита, венесуэльского энцефаломиелита, западного энцефаломиелита лошадей, аденовирусных инфекций и др.
При многих инфекционных заболеваниях изменяется реактивность организма к возбудителю инфекции или его продуктам. Такая измененная реактивность организма называется инфекционной аллергией.







©2015 arhivinfo.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.