 |
|
Глава 12. ПОЛУЧЕНИЕ ИНТЕРФЕРОНА
В 1957 г. ученые обнаружили, что клетки, зараженные вирусом, вырабатывают особое вещество, угнетающее размножение как гомологичных, так и гетерологичных вирусов, которое они назвали интерфероном. Если иммунная система обеспечивает белковый гомеостаз и через него устраняет чужеродную генетическую информацию, то система интерферона непосредственно воздействует на чужеродную генетическую информацию, устраняя ее из организма на клеточном уровне, и тем самым обеспечивает нуклеиновый гомеостаз. Система интерферона тесно взаимодействует с иммунной системой.
Интерфероны закодированы в генетическом аппарате клетки. Гены для человеческого фибробластного интерферона располагаются во 2-й, 9-й и длинном плече 5-й хромосомы, а ген, регулирующий транскрипцию - в коротком плече той же хромосомы. Ген, детерминирующий восприимчивость к действию интерферона, локализован в 21-й хромосоме. Ген для α-интерферона располагается в 9-й хромосоме, для γ-интерферона - в 11-й хромосоме.
Система интерферона не имеет центрального органа, так как способностью вырабатывать интерферон обладают все клетки организма позвоночных животных, хотя наиболее активно вырабатывают его клетки белой крови.
Интерферон спонтанно не продуцируется интактными клетками и для образования его нужны индукторы, каковыми могут быть вирусы, бактериальные токсины, экстракты из бактерий и грибов, фитогемагглютинины, синтетические вещества - поликарбоксилаты, полисульфаты, декстраны, но наиболее эффективными индукторами интерферона являются двунитчатые РНК: двунитчатые вирусные РНК и двунитчатые синтетические сополимеры рибонуклеотидов (поли-ГЦ, поли-ИЦ) и др. Индукция интерферона происходит вследствие дерепрессии его генов.
Типы интерферонов. Известны три типа интерферонов человека: α-интерферон, или лейкоцитарный интерферон, который продуцируется лейкоцитами, обработанными вирусами и другими агентами; β-интерферон, или фибробластный интерферон, который продуцируется фибробластами, обработанными вирусами и другими агентами. Оба эти интерферона принадлежат к типу 1. Более сильный γ-интерферон, или иммунный интерферон, принадлежит к типу 2. Имеется несколько подтипов α-интерферона, и общее число их у человека доходит до 25. Сравнительная характеристика интерферонов человека приведена в таблице. Активность интерферонов измеряется в международных единицах (ME). Одна единица соответствует количеству интерферона, которое ингибирует репродукцию вируса на 50 %.
При индукции интерферонов синтезируется два и более его типов. Так, при индукции интерферона на лимфобластах образуется 87 % лейкоцитарного и 13 % фибробластного интерферона, при индукции интерферона на фибробластах имеют место обратные соотношения. Между тремя типами интерферонов могут существовать синергические взаимодействия.
Таблица 2
Сравнительная характеристика интерферонов человека
Свойства интерферонов. Интерфероны обладают видотканевой специфичностью. Это означает, что интерферон человека действует только в организме человека, но неактивен в организме других биологических видов. Конечно, барьеры видовой специфичности не абсолютны: интерферон человека проявляет некоторую активность в тканях человекообразных обезьян, а куриный интерферон в организме близких видов семейства куриных. Однако активность интерферона в гетерогенных организмах резко снижается.
Поэтому можно заключить, что интерфероны, появившиеся у позвоночных, эволюционировали вместе с хозяевами. Интерферон является относительно устойчивым белком и хорошо переносит кислую среду (рН 2,2), что используется для выделения его и очистки. Антигенные свойства интерферонов мало выражены, в связи с чем, антитела к нему удается получить лишь после многократных иммунизаций.
Интерфероны не обладают специфичностью в отношении вирусов и действуют угнетающе на репродукцию различных вирусов, хотя разные вирусы обладают неодинаковой чувствительностью к интерферону. Чувствительность к нему обычно совпадает с индуцирующей активностью к интерферону. Наиболее часто применяемыми индукторами интерферона и тест-вирусами для его титрования являются рабдовирусы (вирус везикулярного стоматита), парамиксовирусы, тогавирусы. Продукция интерферона зависит также от характера применяемых клеток. Существуют клетки, дефектные по нескольким генам интерферона.
Интерфероны оказывают антивирусное, противоопухолевое, иммуномодулирующее и многие другие действия. Наиболее изучено их антивирусное действие, и именно на вирусных моделях выяснены биологические и другие свойства интерферонов.
Интерферон оказывает противоопухолевое действие при парентеральном введении в больших дозах, связанное с подавлением им цитопролиферативной активности. Добавление интерферона к культуре нормальных клеток сопровождается уже через 2 ч угнетением в них синтеза ДНК. При вирусиндуцированных опухолях интерферон угнетает репродукцию онковирусов и одновременно подавляет цитопролиферативную активность.
Интерферон является регулятором различных механизмов иммунного ответа, оказывая стимулирующее или угнетающее действие на иммунные реакции.
Механизм действия интерферона. Интерферон связывается с клеточными рецепторами, находящимися на плазматической мембране, что служит сигналом для дерепрессии соответствующих генов. В результате индуцируется синтез особой протеинкиназы PKs, которая присутствует в следовых количествах во всех клетках млекопитающих и активируется низкими концентрациями двунитчатой РНК, а в зараженных вирусами клетках - вирусными репликативными комплексами.
Протеинкиназа фосфорилирует а-субъединицу инициирующего фактора трансляции eIF-2, и фосфорилирование блокирует активность инициирующего фактора. В результате иРНК, связанная с инициирующим комплексом, не может связаться с большой рибосомальной субъединицей, и поэтому ее трансляция блокируется. Инициирующий фактор eIF-2 в одинаковой степени необходим для трансляции как клеточных, так и вирусных иРНК, однако преимущественно блокируется трансляция вирусных иРНК, связанных с вирусными двунитчатыми РНК-структурами, в результате локальной активации протеинкиназы.
В обработанных интерфероном клетках индуцируется синтез фермента - синтетазы, которая катализирует 2,5-олигоадениловую кислоту, переключающую действие клеточных нуклеаз на разрушение вирусных иРНК. Таким образом, вирусные иРНК подвергаются разрушению нуклеазами. Блокирование интерфероном стадии инициации трансляции и разрушение иРНК обусловливают его универсальный механизм действия при инфекциях, вызванных вирусами с разным генетическим материалом.
Применение интерферонов. Интерфероны применяются для профилактики и лечения ряда вирусных инфекций. Их эффект определяется дозой препарата, однако высокие дозы интерферона оказывают токсическое действие. Интерфероны широко применяются при гриппе и других острых респираторных заболеваниях. Препарат эффективен на ранних стадиях заболевания, применяется местно, например путем закапывания или введения с помощью ингалятора в верхние дыхательные пути в концентрациях до 3∙104-5∙104 ед 2-3 раза в день. При конъюнктивитах интерферон применяют в виде глазных капель. Интерфероны оказывают терапевтическое действие при гепатите В, герпесе, а также при злокачественных новообразованиях. При этих заболеваниях назначают более высокие концентрации. Препарат применяется парентерально - внутривенно и внутримышечно в дозе 105 ед на 1 кг массы тела. Более высокие дозы оказывают побочное действие (повышение температуры, головная боль, выпадение волос, ослабление зрения и т.д.). Интерферон может вызвать также лимфопению, задержку созревания макрофагов, у детей - тяжелые шоковые состояния, у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями - инфаркт миокарда. Очистка интерферона значительно снижает его токсичность и позволяет применять высокие концентрации. Очистка осуществляется с помощью аффинной хроматографии с использованием моноклональных антител к интерферону.
Генноинженерный интерферон. Генноинженерный лейкоцитарный интерферон получают в прокариотических системах (кишечной палочке). Биотехнология получения интерферона включает следующие этапы:
1) обработка лейкоцитарной массы индукторами интерферона;
2) выделение из обработанных клеток смеси иРНК;
3) получение суммарных комплементарных ДНК (кДНК) с помощью обратной транскриптазы;
4) встраивание кДНК в плазмиду кишечной палочки и ее клонирование;
5) отбор клонов, содержащих гены интерферона;
6) включение в плазмиду сильного промотора для успешной транскрипции гена;
7) экспрессия гена интерферона, т.е. синтез соответствующего белка;
8) разрушение прокариотических клеток и очистка интерферона с помощью аффинной хроматографии.
Получены высокоочищенные и концентрированые препараты интерферона, которые испытываются в клинике.
Человеческий лейкоцитарный интерферон, нативный и концентрированный, предназначен для профилактики и лечения гриппа и других вирусных респираторных заболеваний.
Лейкоцитарный интерферон - видоспецифический белок, синтезируемый лейкоцитами человека в ответ на воздействие вируса-интерфероногена. Интерферон не обладает избирательной противовирусной активностью и действует практически на все вирусы.
Для приготовления интерферона используют лейкоциты свежеполученной донорской крови. Под воздействием вируса - интерфероногена лейкоциты, находящиеся в культуральной среде, синтезируют интерферон. Затем лейкоциты удаляют центрифугированием, вирус инактивируют. Препарат является нативным интерфероном. Для получения концентрированного нативный интерферон дополнительно очищают методом хроматографического разделения на колонках с сефадексом.
Интерферон выпускают в сухом виде в ампулах. Нативный сухой интерферон представляет собой пористый порошок серовато-коричневого цвета, который легко растворяется в дистиллированной воде. Растворенный препарат имеет розовато-красный цвет с опалесценцией. Допускается слабый коричневый оттенок раствора. Концентрированный сухой препарат - пористый порошок серовато-белого цвета, также легко растворяющийся в дистиллированной воде. Раствор препарата имеет сероватый цвет с опалесценцией, допустим слабый желтовато-коричневый оттенок. Посторонние примеси содержаться не должны.
Человеческий лейкоцитарный интерферон выпускают вирусологически и бактериологически стерильным. Противовирусная активность нативного препарата должна быть не менее 32 единиц, концентрированного - 100 единиц. Активность определяется титрованием на первичной культуре клеток кожно-мышечной ткани эмбриона человека с вирусом везикулярного стоматита.
Противопоказаний к применению препарата нет. Интерферон нереактогенен, не вызывает побочных явлений.
Препарат хранят при температуре 4 °С. Срок годности 1 год. По истечению его может быть проведен переконтроль в институте, изготовившем данную серию препарата. При сохранении физических свойств и активности срок годности препарата может быть продлен еще на 3 месяца.