 |
|
Глава 13. КОНТРОЛЬ ПРЕПАРАТОВ
При выпуске микробных препаратов необходим самый тщательный контроль их на всех этапах производства как для определения их полезных качеств, так и для выявления наличия и степени нежелательного воздействия так называемой реактогенности, способности вызывать тяжелые реакции в организме прививаемого в ответ на введение препарата. Повышенная реактогенность препаратов в условиях массового их применения может свести на нет все их полезные свойства. Как бы ни был специфически хорош препарат, он не может быть применен для людей, если он не безвреден.
Производство микробных препаратов находится под многоступенчатым контролем. Основной контроль - это контроль в производственных лабораториях. Здесь в процессе повседневной работы осуществляется разнообразная проверка, в том числе главным образом проверка стерильности после каждой, даже самой незначительной, манипуляции с препаратом.
Вся деятельность производственного отдела находится под повседневным наблюдением отдела биологического контроля (ОБК). Это общепроизводственная лаборатория, задачей которой является наблюдение за точностью выполнения технологического процесса на определенных этапах производства. Препарат контролируется в ОБК иногда после производственного контроля, иногда параллельно или совместно с ним. ОБК выдает разрешение на выпуск и контрольный номер серии препарата.
Всю работу по контролю производства в широком аспекте возглавляет Государственный контрольный институт медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича (ГКИ). Он осуществляет контроль несколькими путями. С одной стороны, в ГКИ непосредственно проверяются образцы препаратов, выборочно направляемых туда производством. Иногда в течение определенного промежутка времени ГК контролирует каждую серию препарата. Это бывает в тех случаях, когда какой-либо препарат впервые вводится в производство вообще или в данном институте. ГКИ выступает в качестве арбитра в тех случаях, когда возникают разногласия в оценке качества препарата между производственными лабораториями и ОБК, и, наконец, он изучает препараты, на которые, поступают рекламации. ГКИ проводит большую работу по апробированию новых препаратов, по разработке различных стандартов, которыми пользуются производственные институты при оценке выпускаемых ими препаратов.
Обычно не реже одного раза в год ГКИ направляет в производственные институты бригады специалистов, которые проводят глубокую, всестороннюю проверку производственной деятельности института.
Основным стремлением каждой производственной лаборатории является проведение контроля таким образом, чтобы все неполадки с препаратом, если они есть, были выявлены внутри производства, до выпуска потребителю, и причины их устранены без вмешательства высших контролирующих организаций.
Проверка стерильности препаратов. Стерильность проверяется посевом препаратов на питательные среды, набор которых и питательные свойства обеспечивают возможность выявления разных представителей бактерий как специфических, из которых, например, приготовлены вакцины, так и посторонних, могущих попасть в препарат при нарушении правил асептики в процессе производства. Обычно для проверки стерильности используются следующие питательные среды: скошенный агар, мясо-пептонный бульон (МПБ)
с 0,5 % глюкозы, МПБ + 0,1 % агара и кусочки мяса. Для контроля препаратов, содержащих в качестве консерванта мертиолят, применяются среды с тиогликолатом натрия. Посевы выдерживают при 37 °С в течение 8 суток.
Выявление сапрофитной флоры и плесеней производится путем посева на среду Сабуро и в МПБ. Посевы выдерживаются в течение 8 дней при температуре 20-22 °С. В случае пророста изучают мазки из посевов и повторно засевают препарат. Если при этом снова вырастают те же микробы, что и в первый раз, препарат бракуют. Если же единичные пробирки прорастают иными микробами, производят посев третий раз. При наличии пророста препарат бракуют. Если обсемененность сыворотки, анатоксина или бактериофага выявляется только посевом, то препараты могут быть профильтрованы через бактериальные фильтры; при наличии видимого пророста препараты бракуются. Не подлежат переработке и бракуются обсемененные вакцины.
В тех случаях, когда вакцина из инактивированных вирусов или риккетсий, специфическая стерильность (отсутствие жизнеспособных, неинактивированных вирусов, риккетсий) может быть установлена лишь в опытах на чувствительных животных, куриных эмбрионах или культурах тканей.
Проверка безвредности препаратов. Безвредность препаратов определяется на чувствительных животных. Чаще всего для этих целей используются морские свинки, белые мыши. Для определения безвредности сывороток их вводят подкожно морским свинкам (по 5 мл подогретого до 37 °С препарата в оба бока). Срок наблюдения 5-7 дней. Сыворотка признается безвредной, если в течение сроков наблюдения животные не погибают и у них не развиваются общие и местные реакции. Аналогичным образом проверяется безвредность анатоксинов с той только разницей, что свинке вводят 5 мл препарата и наблюдение ведут более долго (21-30 дней) для выявления поздних реакций за счет оставшихся недообезвреженными малых количеств токсинов.
Безвредность вакцин определяется на белых мышах, которым препарат в дозе 0,5 мл вводится подкожно. Срок наблюдения 3-5 дней; в течение этого времени мыши должны быть живы и здоровы.
Если препараты содержат консервант фенол, проводится определение избытка его на белых мышах. При избытке консерванта у животных появляются явления отравления (резкая дрожь или гибель животного).
По мере того, как в производстве вирусных препаратов все большее значение стали приобретать культуры тканей, сделался более совершенным контроль безопасности инактивированных вирусных препаратов, направленный на выявление оставшихся жизнеспособными вирусов.
До последнего времени единственной возможностью осуществления такого контроля была постановка биологической пробы, т.е. введение препарата чувствительным животным с последующими «слепыми» пассажами, ведущими к накоплению вируса в тканях. Однако это не всегда гарантировало выявление малых количеств вирусов, вирулентность которых к тому же могла быть снижена в процессе инактивирования. Из истории специфической профилактики известны примеры того, как «инактивированные» вирусные вакцины содержали жизнеспособный вирус и применение их привело к возникновению заболеваний (полиомиелитная вакцина Солка - США). Сейчас вакцина, подлежащая проверке, засевается на культуру ткани, где происходит размножение вируса в том случае, если он остался жизнеспособным. Обогащенная вирусом культуральная жидкость вводится чувствительным животным. Это дает возможность с большей достоверностью обнаружить вирус в «инактивированном» препарате.
Необходимо обратить внимание еще на один вид контроля вакцин. Это проверка переносимости на людях. С этой целью препарат, прошедший все виды контроля, вводится небольшому числу лиц, подлежащих прививкам с последующим тщательным наблюдением за наступающей у них реакцией. Разрешение на выпуск вакцины дается только в том случае, если она не вызывает повышенных реакций. Помимо этой проверки, уже непосредственно перед организацией массовых прививок, вакцина вводится небольшому числу лиц (10-25) из коллективов, подлежащих прививкам. Массовая вакцинация начинается не ранее того, как будет учтена реакция у предварительно иммунизированных лиц. При наличии повышенной реактогенности вакцина выдерживается в течение двух месяцев, после чего снова проверяется. Если и теперь обнаруживается повышенная реактогенность вакцины, серия бракуется.
Определение пирогенности сывороток. В процессе очистки и концентрации сыворотка подвергается воздействию различных химических веществ, процессы обработки не могут проводиться в стерильных условиях, следовательно, есть возможность попадания в препарат микроорганизмов и накопления продуктов их жизнедеятельности. Все это приводит к тому, что некоторые серии очищенных сывороток приобретают так называемую пирогенность - способность вызывать повышение температуры при введении человеку и животным. Во избежание этого осложнения вес выпускаемые серии очищенных сывороток подвергаются специальному контролю.
Опыт ставится на 3 кроликах весом в 1-1,5 килограмма. Исследуемую сыворотку, подогретую до 37 °С, вводят внутривенно из расчета 1 мл на килограмм веса животного. До введения сыворотки и спустя 1, 2 и 3 часа после введения у кроликов измеряется температура. Если хотя бы у одного из трех животных температура повышается на 0,8° и выше, опыт повторяется еще на трех кроликах. Сыворотки признаются пирогенными и выпуску без дополнительной обработки не подлежат, если после повторного исследования из шести кроликов три, либо больше, дадут повышение температуры на 0,8 °С и выше.
Определение иммуногенности вакцин и анатоксинов. Одним из наиболее важных свойств вакцин и анатоксинов является их иммуногенность. Методы определения ее различны.
В принципе определение иммуногенности препаратов осуществляется следующим образом: животных, обладающих чувствительностью к микробам, или токсинам, из которых приготовлены вакцины или анатоксины, иммунизируют этими препаратами по специальным схемам. Через определенные промежутки времени иммунным и контрольным животным вводят установленное количество культуры (в DCL) или токсина (в DLM) и наблюдают за ними в течение тех или иных сроков. При гибели контрольных животных иммунизированные должны оказаться устойчивыми и остаться живыми и здоровыми.
Анатоксины, помимо иммуногенности, изучаются в отношении их антигенных свойств. Для этого используется реакция флокуляции или реакция связывания антитоксина со стандартными сыворотками: оценка анатоксинов производится в первом случае антигенными единицами (АЕ) и единицами связывания (ЕС) - во втором. Единицей связывания анатоксина считается то наименьшее его количество, которое связывает одну антитоксическую единицу соответствующей сыворотки.
Принцип определения антитоксинсвязывающей способности анатоксинов сводится к следующему: разные количества анатоксина смешиваются с определенным количеством стандартной антитоксической сыворотки; после получасового выдерживания в термостате к смесям прибавляют вытитрованную дозу токсина и снова выдерживают в термостате, после чего вводят смесь животным, чувствительным к используемому в опыте токсину. В том случае, если анатоксин прочно связывается с сывороткой, токсин остается свободным, и у животного возникают те или иные проявления интоксикации, характерные для данного токсина.
Наоборот, если анатоксин не связывается с сывороткой, она остается свободной и нейтрализует токсин: у животных в этом случае явления интоксикации отсутствуют.
Качество анатоксина тем выше, чем меньше количество его, связывающее одну антитоксическую единицу, и чем, следовательно, больше единиц связывания содержится в 1 мл препарата. Детали этой реакции здесь, не приводятся, так как они представляют чисто профессиональный интерес. Для большей объективности в оценке иммуногенности испытуемые, вакцины контролируются одновременно со стандартными препаратами, рассылаемыми ГКИ. Иммуногенность изучаемого препарата считается достаточной, если она равна или превышает иммуногенность стандартного препарата. При оценке живых вирусных вакцин учитывается такой показатель, как сероконверсия - изменение титра антител в сторону повышения после введения вакцины. Определяется этот показатель путем титрования парных сывороток, полученных до и после вакцинации.
Определение титра сывороток. Активность антитоксических сывороток выражается в антитоксических единицах. Содержание их в 1 мл называется титром сыворотки.
Для определения титра сыворотки титруют на животных, чувствительных к тому виду токсина, против которого приготовлена испытуемая сыворотка. Так, противостолбнячная, противогангренозные, противоэнцефалитная сыворотки титруются на белых мышах, противодифтерийная - на морских свинках.
Токсины, применяемые для титрации сывороток, должны сохраняться в такой форме и при таких условиях, которые обеспечивают максимальную стабильность их свойств. Для этого применяются сухие токсины, токсины, разведенные глицерином, сохраняемые при низких температурах.
Титрация разных видов сывороток имеет свои особенности, в принципе же она сводится к определению наибольшего разведения сыворотки, при котором она нейтрализует определенное количество соответствующего токсина. Титры противовирусных сывороток определяются с помощью различных реакций, в зависимости от того, против какого проявления действия того или иного вируса направлены антитела. Так, если вирус обладает гемагглютинирующими свойствами, используется реакция торможения гемагглютинации, позволяющая определить антигемагглютинирующие свойства иммунных сывороток; если вирус вызывает дегенерацию клеток в культуре ткани, определяется способность сыворотки нейтрализовать это действие; если введение вируса животным приводит к гибели их, испытывается способность сыворотки предупреждать смертельный исход болезни и т.п. Во всех случаях количество вируса, которое вводится в тот или иной опыт с сывороткой, должно быть тщательно оттитровано. Количество содержавшихся в сыворотках антител устанавливается путем определения максимального разведения их, при котором они нейтрализуют действие определенной дозы вируса. Все ингредиенты, используемые в опытах определения титра антител, должны сохраняться в таких условиях, при которых они в течение более или менее длительного времени не теряют своих свойств. Наиболее отвечает этому требованию хранение в высушенном состоянии при низкой температуре. Определение титра является ответственным разделом процесса изготовления сывороток, требующим большого навыка и тщательности в работе. Полученные в опыте данные сравниваются с результатами одновременной титрации стандартной сыворотки, рассылаемой контрольным институтом.
Определение физических свойств препаратов. В процессе производства определяется цвет, прозрачность (сыворотки, анатоксины, бактериофаги), степень мутности по оптическим стандартам (вакцины) препаратов. Отклонения от обычных свойств заставляют, если это допустимо, производить дополнительную обработку препаратов или браковать их, если необычное свойство нельзя устранить без вреда для основных свойств. Так, не подлежат выпуску мутные сыворотки, гамма-глобулины, нативные анатоксины, бактериофаги или, наоборот, прозрачные вакцины, сорбированные анатоксины. Помутнение первой группы препаратов может быть обусловлено проростом их или плохим качеством ампульного стекла. Необычная прозрачность вакцин является следствием процессов автолиза микроорганизмов, из которых они приготовлены.
Бракуются препараты, в которых образуются неразвивающиеся хлопья. Это может быть следствием неправильной установки рН разбавителей (физиологический, буферный растворы) в процессе производства или опять-таки связано с выщелачиванием недоброкачественного стекла.
Изменения физических свойств препаратов могут наступить при нарушении условий их хранения. Требования к температурному режиму хранилищ для микробных препаратов должны соблюдаться не только в производственных институтах, но и в аптекоуправлениях, санэпидстанциях, больницах и врачебных участках, куда эти препараты поступают для применения.
Физические свойства сухих препаратов проверяются по их растворимости, остаточной влажности и форме таблеток. Они должны быть компактными и быстро растворяться в разбавителях, прилагаемых к ним.
Контроль живых вирусных вакцин. Введение в производство вирусных вакцин из живых аттенуированных вирусов потребовало разработки дополнительных новых методов контроля, направленных на выявление посторонних агентов, могущих попасть в вакцину из органов и тканей животных. В настоящее время существуют вакцины из живых вирусов, для получения которых используются разные субстраты. Так, гриппозная вакцина готовится из штаммов вируса гриппа, выращенных на развивающихся куриных эмбрионах, полиомиелитная - на первичных культурах ткани почек зеленых мартышек. На этом же субстрате выращивается в институте полиомиелита и вирусных энцефалитов штамм вакцинного вируса кори.
Для накопления вакцинного штамма бешенства предложена клеточная культура почек сирийских хомяков. Все эти системы, а также вируссодержащие жидкости, полученные на них и служащие основой для приготовления живых вакцин, требуют самого тщательного контроля.
Обнаружение цитопатогенных и гемадсорбирующих вирусов в культурах тканей. Этот вид контроля осуществляется следующим образом: при внесении вируссодёржащей посевной жидкости в подготовленную для посева культуру ткани некоторое количество матрацев не заражают, но сохраняют в тех же условиях, что и зараженные, просматривая находящуюся в них культуру ткани в течение всего периода их пребывания в термостате для выявления могущих наступить цитопатических изменений в случае присутствия в ткани постороннего вируса. Помимо этого, в процессе культивирования из этих контрольных матрацев собирают культуральную жидкость, которая засевается на первичные культуры различных клеток. За клетками ведется наблюдение в течение двенадцати дней, и если в них не обнаруживаются цитопатические изменения, то осуществляется еще один пассаж на тех же клеточных системах, что и первый.
Культуры, находящиеся в контрольных матрацах, а также клетки первого и второго пассажей, проверяются на наличие феномена гемадсорбции с эритроцитами человеческими, обезьяньими, морских свинок и кур. Если хотя бы в одном контрольном матраце или пассажных культурах обнаруживаются цитопатические изменения или феномен гемадсорбции, вируссодержащая жидкость, собранная с зараженных матрацев этой серии, не может быть использована для приготовления вакцины и бракуется.
Наличие посторонних вирусов в культуре клеток можно определять путем титрования вирусов ECHO и риновирусов, засеянных па первичные культуры фибробластов эмбриона человека и на клетки производственных культур. Отставание титра тест-вирусов на производственной культуре клеток на 2 и более логарифма расценивается как признак заражения их посторонними вирусами.. Такая культура не может быть использована в производстве.
В тех случаях, когда необходимо проверить на отсутствие посторонних вирусов культуральную жидкость, содержащую вирус, который был внесен в культуру ткани (например, вирус полиомиелита), используют специфические сыворотки, содержащие антитела к этому основному вирусу. В предварительных опытах на культурах тканей определяется доза сыворотки, полностью нейтрализующая цитопатогенное действие основного вируса.
В опытах с испытуемой вируссодержащей жидкостью сыворотка применяется в этой дозе. Смесь сыворотки и вируссодержащей жидкости вносится в культуру ткани, за которой ведется наблюдение в течение двух недель. В опытах, направленных на обнаружение посторонних вирусов в тех или иных объектах, используются культуры разных тканей различных животных. Если в культуре обнаруживаются признаки дегенеративных изменений, их относят за счет посторонних вирусов, так как основной вирус нейтрализован сывороткой, и испытуемую вируссодержащую жидкость бракуют.
Если для приготовления вакцины используется вируссодержащая жидкость, полученная от куриных эмбрионов, она должна быть проконтролирована на отсутствие вирусов группы лейкозов птиц. В принципе этот контроль проводится следующим образом: вируссодержащая жидкость нейтрализуется специфической сывороткой, содержащей антитела против основного вируса. После определенного срока выдерживания, необходимого для нейтрализации, смесь вносится в культуру ткани, заведомо свободную от вируса лейкоза птиц (из эмбрионов японских перепелок или кур, выращенных в безлейкозном хозяйстве). Одновременно такие же культуры ткани заражаются вирусом саркомы Рауса (положительный контроль). Для отрицательного контроля оставляют незараженную среду. Все эти среды культивируются в одинаковых условиях, и по истечении двух недель из них готовят путем замораживания и оттаивания антигены для РСК. Реакция ставится с заведомо положительными и отрицательными сыворотками, т.е. содержащими и не содержащими антитела к вирусу саркомы Рауса. В тех случаях, когда положительная сыворотка реагирует с испытуемым антигеном и антигеном из культуры ткани, зараженной вирусом саркомы Рауса (при отрицательных контролях), изучаемая вируссодержащая жидкость не может быть использована для приготовления вакцины и бракуется.
Посторонние агенты обнаруживаются не только в опытах с культурами тканей. Для этих целей используются также опыты на зараженных животных разных видов и разного возраста. Исследуемый материал вводится разными путями внутрикожно, подкожно, внутривенно, в мозг (головкой, спинной), внутрибрюшинно, внутримышечно и т.д. Эти опыты преследуют цель обнаружить вирусы, патогенные для тех или иных животных.
Выявление вируса лимфоцитарного хориоменингита. В опыте используются белые мыши, которым исследуемый материал вводится в мозг по 0,03 мл и внутрибрюшинно по 0,5 мл. Наблюдение за животными ведется в течение трех недель. Если животные заболевают или гибнут, проводится тщательное исследование для выяснения причин. Если доказано, что это не связано с исследуемым материалом, или если животные вообще не заболевают, считается, что материал не содержит вируса лимфоцитарного хориоменингита. Этот вирус может быть обнаружен и на морских свинках, которым исследуемый материал вводится в мозг - по 0,1 мл и внутрибрюшинно - по 5 мл. Наблюдение за животными ведется в течение 42 дней.
Выявление вируса Коксаки. В опыте используются белые мыши-сосунки, не старше суточного возраста. Исследуемый материал вводится им в мозг - по 0,01 мл и внутрибрюшинно - по 0,1 мл. За животными наблюдают в течение двух недель. Если они заболевают или гибнут позже чем через 24 часа после введения материала, их тщательно исследуют для выяснения причин. Исследуемый материал считается годным, если животные вообще не заболевают или если доказано, что заболевания не связаны с инокуляцией
материала.
Выявление вируса В. В опыте используются кролики, которым исследуемый материал вводится внутрикожно по 0,1 мл в десять мест и подкожно по 9 мл (в общей сложности - 10 мл одному кролику). Наблюдение за животными ведется в течение четырех недель. Материал считается годным для производства в том случае, если кролики не заболевают.
Выявление стабильности ЧДК. При использовании в производстве вирусных вакцин культур человеческих диплоидных клеток (ЧДК) проводится систематическая проверка стабильности их кариотипа. Для этого к развивающимся клеткам прибавляют колхицин, затем отслаивают их от стекла с помощью трипсина и готовят из них по специальной гистологической методике препараты, в которых:
а) определяют процент тетраплоидии, для чего подсчитывают число хромосом в 250 метафазах;
б) регистрируют хромосомные и хроматидные разрывы в пятидесяти метафазах;
в) фотографируют пять метафаз и анализируют их согласно принятой классификации.
Тетраплоидия не должна превышать 5 %, количество разрывов 15 %. Отклонения от нормального кариотипа являются противопоказанием к применению культуры в производстве.
Выявление туморогенной активности клеточных культур. В опыте используются сирийские хомяки, которым клеточная культура имплантируется в слизистую защечного мешка, одной группе сама по себе, другой - с кортизоном. Контрольным животным таким же способом имплантируют клетки HеLa. За животными наблюдают в течение 28 дней. Культура признается непригодной для производства вакцины в том случае, если у подопытных животных развиваются макроскопические узелки, прогрессирующие в размерах, а в гистологических срезах из них обнаруживаются признаки злокачественного роста.
Выявление микоплазм (PPLO). В опыте используется среда следующего состава: триптический перевар бычьего сердца + 0,2 % агара + 20 % бычьей сыворотки или пептона Дифко. Исследуемая вируссодержащая жидкость засевается на эту среду. При наличии колоний PPLO микроскопируют мазки, приготовленные из них. Для контроля в такие же среды засеваются известные культуры PPLO.
Раздел 2. ПРЕПАРАТЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ПРОТИВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ, РИККЕТСИОЗНЫХ И ВИРУСНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ