Главная | Обратная связь

Особенности исследования объектов в присутствии фона

Различные виды контроля часто сталкиваются с необходимостью анализа смеси различных загрязнителей. Это вызывает сильные затруднения в идентификации различных веществ, смесь которых может являться многокомпонентной гетерогенной рассеивающей средой. Одним из перспективных подходов для решения такой проблемы является спектральный анализ. Спектральный анализ многокомпонентных сильно рассеивающих сред, отдельные компоненты которых имеют перекрывающиеся полосы поглощения, представляет значительные трудности. Особенности спектроскопии внутреннего отражения позволяет вести анализ подобных систем практически без специальной подготовки образца, что необходимо при экспресс-анализе в так называемых полевых условиях.

Рассмотрим использование некоторых особенностей спектроскопии нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) и многократного НПВО (МНПВО) – показателей преломления исследуемых образцов и фона (n₂, n₃, а также показателей преломления (n₁) и углов падения (θ) ИЭ – для решения задач анализа сложных систем.

1) Разделение с помощью выбора показателей преломления.

Допустим, что требуется провести анализ двухкомпонентной среды, состоящей из веществ 1 и 2, имеющих соответственно показатели преломления n′ и n″ в выбранном для анализа спектральном диапазоне. Исследуемую среду вводим в непосредственный контакт с измерительным элементом (ИЭ) НПВО или МНПВО, показатель преломления которого n₁ удовлетворяет условию
n′ < n₁ < n″. Из этого условия следует, что для вещества 1 можно обеспечить режим ПВО и при θ > θ_кр получить НПВО или МНПВО. Для вещества 2, у которого n″ больше, чем n₁ ИЭ, условие θ > θ_кр выполнено быть не может, ввиду чего не удается обеспечить режим ПВО. Это означает, что в спектрах НПВО (МНПВО) двухкомпонентной среды будут проявляться полосы поглощения только того вещества, показатель преломления которого в выбранном для анализа спектральном диапазоне меньше показателя преломления ИЭ (в нашем примере только вещества 1), даже если эти объекты сильно рассеивают свет и полосы поглощения вещества 1 и 2 совпадают в выбранной аналитической полосе спектрального диапазона.

Таким образом определяется оптическая плотность вещества 1 (D₁), которая пропорциональна концентрации этого вещества в двухкомпонентной среде. Оптическую плотность D₂ вещества 2, которая пропорциональна концентрации этого вещества в среде, находим следующим образом. Если с помощью ИЭ, имеющего показатель преломления, значение которого превышает значения показателей преломления веществ 1 и 2, определим суммарную оптическую плотность этих веществ, то оптическая плотность вещества 2 определяется из выражения: D₂ = D – D₁.

Анализ многокомпонентной среды, состоящей из N компонентов с перекрывающими полосами поглощения, производится с использованием измерительных элементов, имеющих различные показатели преломления, удовлетворяющих условию:

n′ < n₁′ < n″ <...< nⁿ

n′ < n″ < n₁″ <...< nⁿ

..........................

n′ < n″ < ...< n₁ⁿ < nⁿ,

где n′, n″,..., nⁿ – показатели преломления веществ, входящих в исследуемую среду;

n₁′, n₁″,..., n₁ⁿ – показатели преломления материалов ИЭ.

По результатам измерений определяем оптические плотности каждой компоненты, входящей в исследуемую среду, как разность двух последующих измерений и по полученным оптическим плотностям определяем концентрацию каждой компоненты.

Описанная в работе методика была проверена на ИЭ, изготовленных из инфракрасного стекла ИКС-24 и из флюорита (СаF₂) при анализе двухкомпонентной среды, состоящей из хинолина и воды.

2) Разделение с помощью выбора углов падения θ.

Рассмотренный в предыдущем разделе способ анализа многокомпонентных сред требует использования измерительных элементов, выполненных из материалов с разными показателями преломления. Но у исследователя не всегда может оказаться элемент с нужным показателем преломления, поэтому предлагается еще один способ анализа многокомпонентных сред с перекрывающимися полосами поглощения, который также как и предыдущие, основывается на особенностях спектроскопии НПВО.

Допустим, что требуется провести анализ двухкомпонентной среды, состоящей из веществ 1 и 2, имеющих соответственно показатели преломления n′ и n″ в выбранном для анализа спектральном диапазоне. Для каждого из этих веществ может быть осуществлен режим НПВО при условии, что θ > θ_кр,
а θ_кр1 = θ_кр2. Если это условие не выполняется, то указанный режим беспечен быть не может. Если показатели преломления веществ 1 и 2 в выбранном спектральном диапазоне не одинаковы, то можно так выбрать угол падения светового потока, что будет выполняться условие θ_кр1 < θ < θ_кр2. Это означает, что в спектре НПВО двухкомпонентной среды будут проявляться полосы поглощения только того вещества, для которого будет выполняться условие θ > θ_кр (в нашем примере только вещества 1), даже если эти объекты сильно рассеивают свет и полосы поглощения вещества 1 и 2 совпадают в выбранной аналитической полосе спектрального диапазона.

Таким образом определяется оптическая плотность D₁ вещества 1, которая пропорциональна концентрации этого вещества в двухкомпонентной среде. Оптическую плотность D₂ вещества 2, которая пропорциональна концентрации этого вещества в среде, находим следующим образом.

Если с помощью ИЭ, имеющего угол падения светового потока θ, превышающий θ_кр вещества 1 и θ_кр вещества 2, определим суммарную оптическую плотность D этих веществ, то оптическая плотность вещества 2 определяется из выражения: D₂ = D – D₁.

Анализ многокомпонентной среды, состоящей из N компонентов с перекрывающимися полосами поглощения, производится с использованием ИЭ-ов, имеющих углы падения светового потока (или одного ИЭ с переменным углом падения), удовлетворяющих условию:

 

θ_кр1 < θ₁ < θ_кр2 <...< θ_крN

θ_кр1 < θ_кр2 < θ₂ <...< θ_крN

……………………...

θ_кр1 < θ_кр2 <...< θ_N < θ_крN

где θ_кр1, θ_кр2, ..., θ_крN – критические углы для веществ, входящих в исследуемую среду;

θ₁, θ₂, ..., θ_N – углы падения светового потока в измерительных элементах (или в измерительном элементе с переменным углом падения).

По результатам измерений определяем оптические плотности каждой компоненты, входящей в исследуемую среду, как разность двух последующих измерений и по полученным оптическим плотностям определяем концентрацию каждой компоненты.

Следует также отметить, что при приближении угла падения θ к критическому углу θ_кр какой-либо компоненты, происходит сдвиг полосы поглощения этой компоненты в сторону больших длин волн и тем самым в известной мере устраняется влияние данной компоненты на интенсивность компоненты, имеющей критический угол θ_кр1 > θ_кр2.

Практическое использование предложенной методики анализа сложных сильно рассеивающих сред было применение ее для контроля сложной смеси веществ, загрязняющих среду обитания, содержащей белок, смесь липидов и углеводов, смесь н-парафинов от С₁₂ до С₂₂.

3) Известно, что одним из тест-объектов при контроле загрязнения среды обитания являются микроорганизмы, анализ которых затрудняется из-за наличия фона. Поэтому рассмотрим влияние соотношений оптических параметров биообъектов и фона на возможность обнаружения образца.

Известно, что фон, даже непоглощающий, в спектроскопии на проход значительно снижает чувствительность измерения поглощающих компонентов микроорганизмов. Это объясняется в первую очередь рассеивающими непрозрачными частицами фона, которые снижают интенсивность светового потока.

Спектроскопия НПВО свободна от этого недостатка. Проведено сравнение спектральных характеристик МНПВО бактерий E.coli С-85, полученных в области полос поглощения амид 1 и амид 2, и спектральных характеристик такого же количества этих же бактерий в той же области инфракрасного диапазона в присутствии фона (тальк), не имеющего ярко выраженных полос поглощения. Анализ полученных результатов показал, что присутствие фона, не поглощающего в области исследуемых полос микроорганизмов, не влияет на интенсивность и контур этих полос поглощения при концентрациях фона, превышающих концентрацию микроорганизмов примерно в 100 раз. Влияние фона с более высокими концентрациями его в среде с микроорганизмами мы не исследовали. Были использованы элементы МНПВО с различными n₁ при угле падения светового потока θ = 45º при условии, что объекты наносились на рабочие поверхности в виде монослоя.

Все же присутствие фона накладывает много особенностей при записи спектров нарушенного полного внутреннего отражения.

а) Рассмотрим случай, когда показатель преломления микроорганизмов меньше, чем показатель преломления фона (n_2м < n_2ф).

При выполнении этого положения следует очень осторожно относиться к выбору угла падения светового потока. Критический угол падения нужно рассчитывать относительно параметров фона. Но и в этом случае чувствительность измерения будет все равно меньше, чем для случаев, рассмотренных в п. б), так как θ_кр выбирается относительно фона, а не объекта исследования, и чувствительность уменьшится из-за уменьшения глубины проникновения электромагнитного излучения в среду.

Поэтому если неизвестен состав среды, сопутствующий микроорганизмам, нужно очень внимательно относиться к выбору угла падения θ и показателя преломления ИЭ n₁. Наиболее общей рекомендацией может явиться совет выбирать в этом случае ИЭ, изготовленные из материала с наибольшим показателем преломления, с углом падения θ >> θ_кр в ущерб чувствительности измерения.

Однако если использовать ИЭ с переменным углом падения и изменять этот угол, превышая критический для объектов изменения, но не доходя до критического для фона, то будем на выходе ИЭ иметь сигнал только от образца, но не от фона. Использование синхронной обработки сигнала дает возможность получения очень высокой чувствительности изменения.

б) Рассмотрим случай, когда показатель преломления микроорганизмов в анализируемой полосе поглощения больше или равен показателю преломления фона (n_2м > n_2ф).

Если запись спектров НПВО производится в режиме «тонкой пленки», то θ_кр определяется только значениями n₁ и n₃ (показатель преломления третьей среды).

Если запись спектров НПВО производится в режиме «массивного образца», а микроорганизмы нанесены на рабочие поверхности ИЭ в виде монослоя, то фон не может мешать измерениям. Но если на ИЭ нанесено несколько слоев микроорганизмов и свет проникает за первый слой, то далее он может взаимодействовать как с микроорганизмами, так и с фоном. В этом случае вычисление d_эф (эффективная толщина образца) может оказаться не простой задачей, так как зависимость для d_р (глубина проникновения светового потока в образец) будет определяться как режимом «массивного образца», если свет взаимодействует со вторым слоем микроорганизмов, так и режимом «тонкой пленки», если за объектами исследования находится фон. Поэтому количественные измерения можно вести только при условии, что свет не проникает за первый слой микроорганизмов. Это условие легко выполняется с помощью выбора угла падения θ и относительно показателя преломления n₂₁, если известны размеры микроорганизмов. Если же измерения проводятся на неизвестных объектах, то будет происходить потеря чувствительности измерения на величину, равную отношению глубины проникновения светового луча, выбранной для минимально возможной предлагаемой толщины объекта, к реальной толщине объекта (при условии, что анализируемая компонента микроорганизмов равномерно распределена по их глубине, если это условие не выполняется, то зависимость будет более сложной).

Иногда требуется очень высокая чувствительность измерения, т.е. необходимо проанализировать среду при наличии всего единиц клеток. Для этого предлагается следующий вариант контроля.

Известно, что в полосах поглощения наблюдается дисперсия показателя преломления. И если показатель преломления микроорганизмов в анализируемой полосе поглощения в этом случае окажется выше показателя преломления измерительного элемента и фона, то поглощение света микроорганизмами усиливается, причем наибольшее усиление поглощения света достигается при использовании параллельной компоненты плоскополяризованного света. На рис. 5.10 представлена спектральная характеристика, полученная с помощью ИЭ с углом падения θ = 80º, изготовленного из фтористого бария (ВаF₂).

Усиление поглощения света микроорганизмами объясняется тем, что рассчитанный угол падения светового потока может стать меньше критического угла, если значение показателя преломления микроорганизмов в выбранной полосе поглощения n_2м(λ) > n₁. Когда имеет место это неравенство, то это означает, что свет попадает из оптически менее плотной среды в более плотную и наблюдается преломление света (в нашем случае это эквивалентно тому, что происходит увеличение поглощения света).

Рис. 5.10. Спектральные характеристики

Рассмотренные особенности использованы при разработке метода повышения чувствительности измерения, если стоит задача обнаружения (регистрации) в среде небольшого количества микроорганизмов или их компонентов. Зная дисперсию оптических постоянных микроорганизмов, необходимо так выбрать θ и n₁, чтобы в области анализируемой полосы поглощения выполнялось неравенство n_2м(λ) > n₁. В этом случае будет резкое возрастание интенсивности поглощения.

Чувствительность измерения можно повысить до регистрации всего одной клетки, если использовать приемы оптимальной обработки информации, например, с применением синхронного детектирования. В этом случае необходимо промодулировать по определенному закону сигнал только того объекта, анализ которого ведется. Все остальные объекты, присутствующие на ИЭ, не должны быть промодулированы.

Это возможно осуществить следующими способами.

1) По определенному закону изменять длину волны источника излучения: работая то на длине волны, где происходит поглощение исследуемым объектом, то на длине волны, где нет поглощения. В первом случае из-за дисперсии показателя преломления образца n_2м(λ) > n₁. Затем с помощью накопления сигнала синхронным детектором обеспечивается практически любое усиления сигнала от измеряемого объекта. Величина этого сигнала будет определяться лишь временем его накопления.

2) По определенному закону изменять длину волны источника излучения: работая на длине волны, где происходит поглощение исследуемым объектом, осуществляют изменение угла падения светового потока. В этом случае по определенному закону осуществляется условие возникновения НПВО или преломления для исследуемого образца, если по этому же закону угол падения светового потока будет либо больше, либо меньше критического для исследуемого образца. Таким образом осуществляется модуляция сигнала для исследуемого образца. Затем с помощью накопления сигнала синхронным детектором обеспечивается практически любое усиления сигнала от измеряемого объекта. Величина этого сигнала будет определяться лишь временем его накопления.