 |
|
Приклад тестів «Крок 1».
1.Під час спалаху гострої респіраторної інфекції з метою встановлення діагнозу грипу проводиться експрес-діагностика, яка ґрунтується на виявленні специфічного вірусного антигену в досліджуваному матеріалі (змив з носоглотки). Яку реакцію використовують для цього?
А. Преципітації
В.* Імунофлюоресценції
С. Опсонізації
D. Зв’язування комплементу
Е. Аглютинації
2.При багатьох інфекційних хворобах у крові хворого можна виявити антигени збудника. Яку реакцію слід застосувати, враховуючи, що рівень антигенемії низький?
A. *Твердофазний ІФА
B. Реакцію аглютинації
C. Реакцію непрямої гемаглютинації
D. Реакцію латекс-аглютинації
E. Імуноелектрофорез
3. Істотним недоліком мікроскопічного методу діагностики інфекцій є його недостатня інформативність у зв’язку з морфологічною подібністю багатьох видів мікроорганізмів. Яка імунологічна реакція дозволяє значно підвищити інформативність цього методу?
A. *Реакція імунофлюоресценції
B. Реакція Кумбса
C. Імуноферментний аналіз
D. Реакція опсонізації
E. Радіоімунний аналіз
4. При проведенні лабораторної діагностики гепатиту В в останні роки визначають наявність вірусної ДНК в крові хворого. За допомогою якої із перелічених реакцій встановлюють це?
A. * Ланцюгової полімеразної реакції.
B. Реакція непрямої гемаглютинації.
C. Реакція зв'язування комплементу
D. Імуноферментний аналіз
E. Реакція гальмування гемаглютинації
Ситуаційна задача.
У хворого за ходом міжреберних нервів з’явилася пухирцева висипка у вигляді обруча, з больовим синдромом. А. Яке дослідження найбільш ефективне для експрес-діагностики антигену у клітинах? В. Яке обладнання та які компоненти необхідні для постановки цієї реакції?C. За якими ознаками оцінюється результат реакції?
Зміст і хід заняття:
Робота 1.Облік реакції імунолюмінесценції.
Принцип реакціїпередбачає використання антитіл, молекули яких зв’язані з люмінесцентним барвником (мічені або позначені антитіла, мічені сироватки). Такі антитіла зв’язуються з антигенами, наприклад із антигенами на поверхні бактеріальної клітини і така клітина буде світитися при дослідженні в люмінесцентному мікроскопі (антитіла, які не зв’язалися з відповідними антигенами, відмиваються під час обробки мазка).
Хід роботи: Препарат-відбиток з лімфатичного вузла тваринки, що загинула від експериментальної інфекції обробили люмінесцентною сироваткою проти збудника хвороби. Після промивання і висушування препарат досліджують за допомогою люмінесцентного мікроскопу. Мікроскопічна картина: на блакитно-зеленому фоні препарату видно яскраво-зелені паличкоподібні бактерії, які світяться завдяки тому, що на їхній поверхні мічені люмінесцентні антитіла специфічно зв’язались з антигенами бактеріальної клітини. Замалювати препарат, скласти схему реакції.
Практичне значення.Реакцію прямої імунофлюоресценції використовують для вивчення клітинних антигенів, виявлення вірусу в заражених клітинах та бактерій і рикетсій в мазках. Так, для діагностики сказу, відбитки кусочків мозку тварин, підозрюваних на вірусоносійство, обробляють люмінесцентною антирабічною сироваткою. При позитивному результаті в цитоплазмі нервових клітин виявляються комплекси яскраво-зеленого кольору. На виявленні антигенів вірусів в клітинах відбитків зі слизової оболонки носа заснована експрес-діагностика грипу, парагрипу і аденовірусної інфекції.
Робота 2. Імуноферментний метод (ІФА).
Принцип методу.Антиген взаємодіє з антитілом, при цьому один з реагентів зв’язаний з ензимом. Для виявлення цієї ензимної мітки необхідний відповідний субстрат (хромоген), який реагує в місці з’єднання антигена з антитілом з мобілізованим ферментом, змінюючи забарвлення реагуючої суміші Для такої мітки широко використовується фермент – пероксидаза хрону, яка в залежності від субстрату дає різнокольорові продукти реакції. Розрізняють прямі і непрямі імуноферментні методи. Прямий метод. На першому етапі реакції антиген реагує з антитілом, міченим пероксидазою, потім до утвореного комплексу додають відповідний субстрат (наприклад, Н2О2 і 5-аміносаліцилову кислоту). Непрямий метод. Спочатку антиген реагує з антитілами, утворюючи комплекс антиген – антитіло, після промивання у систему вносять протиглобулінові антитіла, мічені пероксидазою, які зв’язуються з першим комплексом. Після наступного промивання вносять субстрат, який, розкладаючись адсорбованим ензимом, зумовлює появу відповідного забарвлення.
Хід роботи:Виявити антигени збудника в досліджуваному матеріалі за допомогою реакції ІФА. На дні і стінках лунок полістиролового планшету адсорбовані специфічні антитіла. У лунки вносять декілька зразків досліджуваних матеріалів, у яких виявляють антиген. Після 30-ти хвилинної інкубації в термостаті лунки промити промивним розчином і внести кон’югат - антитіла, з’єднані з пероксидазою. Після 30-ти хвилинної інкубації знову промити лунки і внести суміш пероксиду водню і хромогену. Після 30-ти хвилинного витримування в термостаті реакцію зупиняють стоп-реагентом і відмічають номери зразків, у яких виявлено антиген (зміна кольору хромогена).
Робота 3. Виявлення антитіл у сироватках в реакції ІФА.
Хід роботи: У лунках планшету для ІФА адсорбований стандартний антиген. У лунки внесли зразки досліджуваних сироваток, а після інкубації та промивання - кон’югат (мічені пероксидазою антитіла проти імуноглобулінів людини). Після повторної інкубації та промивання внесено субстрат і хромоген. Відмітити, у яких зразках сироваток виявлено специфічні антитіла. Скласти схему реакції.
Практичне значення. Сучасні методи імунологічних досліджень при інфекційних хворобах дають можливість безпосереднього виявлення антигенів збудника, виявлення антитіл окремих класів - IgG, IgM, IgA. Експрес-методи характеризуються достатньо високою специфічністю, швидкістю виконання.
Робота 4.Полімеразна ланцюгова реакція.
Принцип реакції - синтез копій досліджуваного гена в спеціальних автоматичних приладах - ампліфікаторах. Основою тест-системи в ПЛР є праймери - синтетичні олігонуклеотиди, комплементарні до певної ділянки гена, що виявляється і фермент ДНК-полімераза. Система також містить нуклеотиди, з яких синтезуються копії гену. Цикл ПЛР складається з послідовних процесів синтезу і плавлення (розкручування ниток ДНК). Під час синтезу праймер приєднується до комплементарної ділянки ДНК-гена, який копіюється (ампліфікація), утворюючи двоспіральну структуру. З цієї двоспіральної ділянки ДНК-полімераза започатковує синтез копії гена. При нагріванні ця новосинтезована ДНК розкручується на 2 нитки, які в свою чергу, знову копіюються при охолодженні з утворенням чотирьох ниток. Після 30-40 циклів ген копіюється в достатніх кількостях і виявляється в реакції молекулярної гібридизації. Для цього одноланцюговий зонд (короткий фрагмент нитки ДНК) мітиться ферментом, ізотопом або іншою міткою. Отримані ДНК денатуруються (т.т. розділяються на поодинокі нитки). Після інкубації зонда з досліджуваним зразком вимірюють кількість поміченої ДНК, яка зв’язалась (вступила в гібридизацію) з нуклеїновими кислотами досліджуваної ДНК.
Хід роботи:Скласти схему полімеразної ланцюгової реакції, вказати її призначення і область застосування.
Практичне значення.За результатами цієї реакції можна підтвердити діагноз інфекційної хвороби ще до появи антитіл, це особливо важливо щодо збудників, яких неможливо виділити з організму або вони виділяються з труднощами (вірусні інфекції).
Складання протоколів.Описати хід постановки і результати реакції імунолюмінесценції (1), імуноферментного аналізу (2, 3), скласти схему полімеразної ланцюгової реакції (4).
Література.
1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. – М., 2005. – C. 217-222, 314-320, 323-325.
2. Воробьев А.А. Медицинская микробиология, вирусология
и иммунология.-М., 2008.-С.289-294.
3. Данилейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П. Мікробіологія з основами імунології. Київ, Медицина, 2009. – С.185-186, 327-328.
4. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П.Практична мікробіологія: Посібник .Тернопіль.-Укрмедкнита. 2004,-С.145-149.
5. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. – С.-П., 2002. – С. 187-191, 236-237.
6. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія (під ред. акад. Широбокова В.П.). – Вінниця., “Нова книга”. – 2011. С.288-293.
7. Методичний посібник до практичних занять з імунології та алергології (під.ред. проф. Данилейченка В.В.).- Львів, 2000. С.21-25, 50, 61.