Главная | Обратная связь

Зміст і хід заняття.

Робота 1. Серологічна ідентифікація чистої культури бактерій в реакції аглютинації (РА) (розгорнута реакція аглютинації).

Принцип методу.Різні споріднені види бактерій, а також різні серовари, з яких складаються окремі види бактерій, містять спільні антигенні детермінати. Такі мікроорганізми під час проведення орієнтовної РА можуть перехресно реагувати з однією полівалентною аглютинуючою сироваткою або сумішшю діагностичних сироваток. Тому при позитивному результаті орієнтовної реакції для кінцевої ідентифікації мікроорганізмів ставлять розгорнуту реакцію аглютинації з окремими монорецепторними сироватками.

Практичне значення.Розгорнутою реакцією аглютинації визначать антигенну структуру, титр, що дозволяє ідентифікувати вид збудника за антигенню структурою до сероваріанту.

Робота 2. Постановка реакції преципітації в агарі.

Принцип методу. Суть реакції преципітації в агарі полягає в тому, що специфічні антиген та антитіло дифундують у порах гелю назустріч один одному і, зустрічаючись, взаємодіють між собою, уворюючи комплекс, у вигляді видимої візуально лінії преципітації.

Хід роботи: У шарі спеціально підготованого агару (на буферних розчинах) вирізані 5 лунок. У центральну лунку внесена імунна сироватка, в бокові — досліджувані антигени І, ІІ, ІІІ і ІV. При відповідності одного чи кількох антигенів імунній сироватці в агарі між центральною і відповідною боковою лункою утворюється лінія (дуга) преципітації. Визначити наявність додатньої реакції преципітації в демонстраційних пластинах.

Практичне значення.Метод використовується як для якісного аналізу (підтвердження токсигенності), так і для кількісного визначення антигенів.

Робота 3. Серологічна діагностика. Визначення титру антитіл у сироватці хворого (розгорнута реакція аглютинації).

Принцип методу.Утворення конгломератів, антиген-антитіло, які випадають у осад і видимі неозброєним оком.

Хід роботи:У пробірках приготувати розведення сироватки (в об'ємі 1 мл): 1 : 100, 1 :200, 1 : 400, 1 : 800, К. В останню пробірку для контролю наливають тільки фізіологічний розчин. Розведення сироватки проводять за схемою:

Після додавання антигену пробірки струсити і поставити на 4 год. в термостат, а потім витримати при кімнатній температурі.

 

ІНГРЕДІЄНТИ	ПРОБІРКИ
Фізіологічний розчин, мл
Імунна сироватка 1: 50, мл	переносити 1мл з 1-ї в 2-гу, з 2-ї в 3-тю і т. д.; з 5-ї пробірки 1мл вилити
Одержуване розведення сироватки	1:	1:	1:	1:	1:	К
Антиген	Діагностикум вносити в кожну пробірку по 1 краплі

 

Облік реакції. Розглянути, не струшуючи, кожну пробірку і порівняти дослід із контролем. Звернути увагу на наявність помутніння, пластівців, осаду. Визначити характер аглютинації — зернистий осад (0-аглютинація), пластівцевий осад (Н-аглютинація). Визначити інтенсивність аглютинації додатніми знаками і відмітити останню пробірку з додатнім результатом, керуючись наступними ознаками: "4+"—наявність широкого з "нерівним" краєм осаду, рідина над осадом – прозора, при струшуванні пробір­ки—пластівцева чи зерниста завісина в прозорій рідині; "3+" — ви­ражений осад меншого діаметру, над осадом – незначне помутніння рідини, при струшуванні – завісина пластівців чи зерен менших роз­мірів, ніж у попередньому випадку. При подальшому зменшенні діаметру осаду, розмірів пластівців чи зерен, збільшенню мутності рідини при струшуванні ступінь аглютинації відмічається "2+" чи "+" . Наявність на дні пробірки невеликого, компактного осаду з рівним краєм, поява при легкому струшуванні мутних "змійок", які підні­маються із дна пробірки, а при сильному струшуванні — рівномір­ного помутніння рідини без зернистості і пластівців, свідчать про від'ємну реакцію аглютинації "—". Визначити титр антитіл в імун­ній сироватці. Зробити висновок про діагностичне значення реакції аглютинації.

Практичне значення.Розгорнутою реакцією аглютинації визначають титр сироватки, що дозволяє підтвердити протікання інфекційної хвороби.

Робота 4.Серологічна діагностика. Виявлення антитіл та встановлення їх титру в реакції непрямої гемаглютинації ( РНГА).

Принцип методу.Реакція ґрунтується на використанні інертних частинок-носіїв, на яких адсорбовані молекули відомої розчинної специфічної речовини, що бере участь в реакції “антиген-атитіло”. В якості такого інертного носія у даному випадку використовують еритроцити.Завдяки використанню реагентів, адсорбованих на частинках носія,РНГА за своєю чутливістю значно перевищує реакцію прямої аглютинації, преципітації та РЗК.Інтенсивність реакції оцінюють візуально.

Хід роботи:Сироватку хворого розвели у лунках полістиролових планшетів 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, (в об'ємі 0,5 мл). У кожну лунку внесли еритроцитарний діагностикум. Контролі: К₁ -завісина еритроцитів, не оброблених антигеном, + сироватка ; К₂ - сироватка, що не містить антитіл та еритроцитарний діагностикум. Реакція проходить при кімнатній температурі, облік проводиться через 30—45 хв. При позитивній реакції еритроцити аглютинуються внаслідок реакції між антитілами, які є в сироватці хворого, і антигеном, адсорбованим на еритроцитах. При цьому утворюється осад з нерівними краями по всьому периметру дна лунки - "парасолька". В контролях (негативна реакція) — еритроцити неаглютиновані, осідають у центрі лунки щільним скупченням з рівними краями. Визначити найбільше розведення сироватки, в якому пройшла реакція непрямої гемаглютинації. . За титр антитіл вважається найбільше розведення сироватки крові в якому пройшла реакція з утворенням комплексу антиген-антитіло у вигляді осаду на дні пробірки.

Практичне значення.Розгорнутою непрямою реакцією гемаглютинації визначать титр антитіл, що дозволяє підтвердити перебіг хвороби.

Робота 5. Реакція бактеріолізу.

Принцип реакції.Реакція бактеріолізу ґрунтується на приєднанні комплементу до комплексу “антиген-антитіло”. При цьому специфічні антитіла взаємодіють з антигенами бактерій і активують комплемент класичним шляхом.Внаслідок цього бактерії руйнуються і МПБ стає прозорим.

Хід роботи: Постановку реакції бак­теріолізу проводять у двох пробірках з МПБ.

В обидві пробірки була засіяна жива культура мікроорганізмів. У дослідну пробірку внесена специфічна імунна сироватка і комплемент. Пробірки по­міщають у термостат на добу. Провести облік реакції, спостерігаючи відсутність росту в дослідній пробірці і наявність росту (помутнін­ня) в контрольній пробірці. Пояснити результати реакції, які спостерігаються.

Практичне значення.Реакція бактеріолізу in vitro є моделлю відповідних реакцій в організмі ,що визначає відповідні патогенетичні механізми.

Робота 6. Реакція імунного гемолізу.

Принцип реакції.Реакції імунного гемолізу належать до реакції лізису,що ґрунтується на приєднанні комплементу до комплексу “антиген-антитіло”. При цьому специфічні антитіла взаємодіють з антигенами еритроцитів і активують комплемент класичним шляхом. Внаслідок цього еритроцити руйнуються і суміш реагентів стає прозорою (“лакова кров”).

Хід роботи: Постановка реак­ції гемолізу проводиться за схемою:

 

 

Інгредієнти	Пробірки
Еритроцити барана (3 % завісина)     завісина)	0,5	–	0,5	0,5	0,5
Еритроцити собаки (3 % завісина)	–	0,5	–	–	–
Гемолітична сироватка (містить антитіла до еритроцитів барана)	0,5	0,5	–	0,5	–
Комплемент 1 :10	0,5	0,5	0,5	–	–
Фізіологічний розчин	–	–	0,5	0,5	1,0
	Термостат 37°С—30 хвилин
Очікуваний результат	Ге-мо-ліз	Від-сут­ність ге-мо-лізу	Від-сут­ність ге-мо-лізу	Від-сут­ність гемолізу	Від-сут­ність гемолізу

 

Облік реакції проводять після витримування пробірок у термо­статі протягом 30 хв. при 37°С. Позитивний результат (гемоліз, лакова кров) відмічають у першій пробірці, де є всі необхідні ін­гредієнти реакції (антиген, специфічні антитіла, комплемент). Ін­ші пробірки — контроль.

Пояснити, чому в контрольних пробірках не спостерігається гемоліз.

Практичне значення.Таку трикомпонентну реакцію гемолізу використовують для визначення титрів гемолітичних сироваток і якості препаратів комплементу.Крім того, вона є частиною таких серологічних діагностичних тестів,як реакція зв’язування комплементу.

Робота 7. Приготування інгредієнтів для реакції зв'язування комплементу:

Хід роботи:а) антиген — завісина вбитих мікробів. Перед поста­новкою РЗК визначають його титр і робочу дозу; б) антитіла — містяться в одній із досліджуваних сироваток. Перед введенням у реакцію всі сироватки інактивують (56°С — 30 хв.) для руйнування комплементу і створення оптимуму колоїдного стану; в) гемолітич­на система — сироватка крові кролика, попередньо імунізованого еритроцитами барана. Перед постановкою реакції встановлюють титр сироватки. Для реакції сироватку розводять до 1/3 титру і да­ють еквівалентну кількість 3% завісини еритроцитів барана; г) комп­лемент — складна білкова система, яка міститься в свіжій сироват­ці крові. Для реакції комплементом служить сироватка крові мор­ської свинки. Титр і робочу дозу комплементу встановлюють у реакції гемолізу.

Робота 8.Постановка і облік реакції зв'язування комплементу (серологічна діагностика).

Принцип методу. РЗК ґрунтується на використанні двох систем “антиген-антитіло”, що конкурують між собою зв’язати комплемент. Перша з них є системою основного досліду, що містить антиген-антитіло. Один із цих реагентів є відомим, а інший - компонентом, що досліджується. До цієї ж системи додають комплемент. Друга,або гемолітична,система складається з еритроцитів барана і гемолітичної сироватки. РЗК відбувається у дві фази. У першій фазі антиген основного досліду взаємодіє з відповідним антитілом,якщо ці обидва реагенти знаходяться у пробірці. Для оцінки результату реакції до дослідної пробірки вносять гемолітичну систему. У другій фазі комплемент зв’язується комплексом ”антиген-антитіло” першої або другої системи, якщо у першій системі не вистачає одного компонента.

Хід роботи: РЗК ставлять за схемою:

Інгредієнти	Пробірки
Досліджувана сироватка (у розведенні)	0,5	–	–
Сироватка завідомо здорової людини     людини	–	0,5	–
Сироватка завідомо хворої людини	–	–	0,5
Антиген (у робочій дозі)	0,5	0,5	0,5
Комплемент (у робочій дозі)	0,5	0,5	0,5
Термостат 37°С— 1 годину, чи 4—8°С—18—20 годин

Гемолітична система	1,0	1,0	1,0
Термостат 37°С - 30 хвилин
Очікувані результати	Затримка гемолізу	Гемоліз	Затримка гемолізу

 

Провести облік реакції: "4+" – "повна затримка гемолізу" (компакт­ний осад еритроцитів, безколірна рідина над осадом); "3+" – "майже повна затримка гемолізу" (осад еритроцитів, рідина над осадом – злегка зафарбована); "2+" – "часткова затримка гемолізу" (невеликий осад еритроцитів, інтенсивно зафарбована рідина над осадом); "+" – "слабка затримка гемолізу" (осад відсутній, зафарбована непрозора рідина – “лакова кров”); "–" - "гемоліз" (зафарбована прозора рідина).

Практичне значення. РЗК більш специфічна, її застосовують у діагностиці сифілісу (реакція Вассермана), висипного тифу, туляремії, лістеріозу та інших бактеріальних інфекцій, а також багатьох вірусних та протозойних захворювань.

Складання протоколів. Описати принцип реакції (робота 1), принципи, методики постановки реакцій (роботи 2, 3, 4, 5, 6, 8).

Література.

1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. -М., 2005.-С. 328-337.

2. Воробьев А.А.-Медицинская микробиология, вирусология и иммунология.-М.,2004.-С. 283-286.

3. Данилейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П. Мікробіологія з основами імунології. – Медицина, 2009. С.181-183.

4. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. - С.-П., 2002. - С. 227-236.

5. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія. – Тернопіль., “Укрмедкнига”. – 2004. – С.125-141 .

6. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія (під ред. акад. Широбокова В.П.). – Вінниця., “Нова книга”. – 2011. С.276-279.285-288.

7. Методичний посібник до практичних занять з імунології та алергології (під.ред. проф. Данилейченка В.В.).- Львів, 2000. С.21-25.

Заняття 13.

Тема:Серологічні реакції з мітками.

Актуальність. У всіх областях сучасної медицини використовується імунний аналіз, переважно, з діагностичною та аналітичної цілями. Використання діагностичних препаратів,мічених флюоресцентними барвниками, ферментами, радіоактивними мітками дозволяє значно підвищити чутливість реакцій і ідентифікувати біологічні компоненти (гормони, ферменти, нейропептиди, продукти імунної системи, антигени і т.д.) в низьких і дуже низьких концентраціях. Всі продукти, проти яких можливе отримання антитіл, виявляються цими методами. Знання основ імунологічної трансплантології дуже важливе для підбору трансплантантів та попередження процесів їх відторгнення.

Мета і завдання.Ознайомлення з принципами реакцій, технікою їх постановки та можливостями методів імуноферментного аналізу, імунолюмінесцентного аналізу, радіоімунного аналізу, полімеразної ланцюгової реакції, комплексу гістосумісності та основ трансплантології.

Практичні навики.

1.Вибрати препарати та скласти схему постановки прямої та непрямої реакції імунофлуоресценції

2. Дослідити препарат з використанням прямого методу люмінесцентної мікроскопії, виявити люмінесцентні комплекси антигенів з міченими антитілами

3. Вибрати компоненти реакції, скласти схему етапів постановки твердофазного ІФА

4. Поставити модельну реакцію та провести облік непрямої реакції ІФА.

Контрольні питання.

1. З якою метою і які мітки використовують в прикладній імунології?

2. Переваги реакцій з міченими сироватками над класичними. Можливість застосування їх для експрес-діагностики.

3. Принцип реакції імунофлуоресценції (РІФ).

4. Одержання антивидових мічених імуноглобулінів. Застосування їх для РІФ.

5. Імуноферментний аналіз. Інгредієнти для постановки прямого та непрямого ІФА.

6. Твердофазний ІФА та імуноблотінг.

7. Принцип постановки реакцій радіоімунного аналізу (конкурентний тип реакції, пряма та зворотня РІА).

8. Імунна електронна мікроскопія

9. Полімеразна ланцюгова реакція.

 

Тестові завдання.

1.Для одержання мічених антитіл використовують маркери:

A. Флуорохром

B. Альбумін

C. Ферритин

D. Латекс

E. Бактеріофаг

2. Для діагностики багатьох інфекційних захворювань існують діагностичні тест- системи для постановки ІФА. Виберіть компоненти, необхідні для ІФА з метою виявлення антитіл у сироватці хворого.

A. Антиген на твердій фазі, сироватка хворого, мічена ензимом антиглобулінова сироватка, субстрат

B. Сироватка хворого на твердій фазі, антиген, субстрат

C. Сироватка хворого, специфічний антиген, антиглобулінова сироватка, ензим, субстрат

D. Антиген, специфічна сироватка, ензим, субстрат

E. Сироватка хворого, специфічна сироватка з ензимом, субстрат

3. Виберіть компонент, необхідний для реакції імунофлуоресценції (виявлення бактерій у мазку прямим методом)

A.Сироватка хворого

B. Люмінесцентна сироватка проти імуноглобулінів людини

С.Стандартний антиген

D. Мічена антибактеріальна сироватка

E. Мічений анти видовий імуноглобулін

4. Який з названих препаратів необхідний для виявлення антигену, адсорбованого на твердій фазі методом ІФА?

A. Мічена сироватка проти глобулінів людини

B. Досліджувана сироватка, що містить антитіла

C. Комплемент

D. Cпецифічна мічена сироватка

Е.Стандартний антиген

5. Об’єктом розпізнавання для антигенрозпізнавального рецептора Т4-лімфоцита є:

 

А. Антиген чужерідний

B. МНС-II

C. Комплекс МНС-I з антигеном

D. Комплекс МНС-II з антигеном

E. МНС-I